ゲノム

Sep 15, 2023

Nature Communications volume 13、記事番号: 7962 (2022) この記事を引用

3431 アクセス

1 引用

20 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ペニシリン結合タンパク質 (PBP) の d,d-トランスペプチダーゼ活性は、ペプチドグリカンの重合をブロックする β-ラクタム系抗生物質の主な標的であることがよく知られています。 β-ラクタムによる細菌の死滅には複雑な下流反応が関与しており、その原因と結果を解決するのは困難です。 今回我々は、β-ラクタム非感受性1,d-トランスペプチダーゼによるPBPの機能的置換を利用して、活発に分裂する細菌におけるβ-ラクタムによるPBP不活化の影響を軽減するために不可欠な遺伝子を同定する。 このアプローチによって同定された 179 個の条件付き必須遺伝子の機能は、ペプチドグリカン重合の 1,d-トランスペプチダーゼ パートナーをはるかに超えて、ストレス応答や外膜ポリマーの構築に関与するタンパク質にまで及びます。 β-ラクタムの予期せぬ影響には、外膜とペプチドグリカンを結び付けるリポタンパク質を介した共有結合の喪失、ペプチドグリカンの効果的な架橋にもかかわらず細胞エンベロープの不安定化、外膜の透過性の増加などが含まれます。 後者の効果は、β-ラクタムの作用機序が外膜の自己促進的な浸透に関与していることを示しています。

大腸菌などのグラム陰性菌は、細胞質の膨圧を維持する多層エンベロープ (細胞壁ペプチドグリカン) を持ち、栄養素、老廃物、有毒化合物 (内膜と外膜) に対する選択的な化学障壁として機能します (図) . 1a)1． タンパク質、ペプチド、グリカン、脂質部分を含むいくつかのポリマーが、エンベロープの機械的特性と輸送機能を保証します。 ブラウンリポタンパク質を介して外膜に共有結合しているペプチドグリカン（PG）は、二糖-ペンタペプチド単位から重合した巨大な網状高分子（約109Da）です（図1b）。 グリコシルトランスフェラーゼは、二糖間のβ-1,4グリコシド結合の形成を触媒してグリカン鎖を形成し、その後トランスペプチダーゼによって相互に架橋されます（図1c）。 後者の酵素である d,d-トランスペプチダーゼは、β-ラクタム系抗生物質の必須の標的であるため、ペニシリン結合タンパク質 (PBP) とも呼ばれます。 ペプチドグリカンの重合では、PBP はペンタペプチドステムの d-Ala4-d-Ala5 末端と相互作用し (したがって d,d と呼ばれます)、d-Ala4 とその活性部位の Ser 残基との間に共有結合を形成し、同時に d が放出されます。 -アラ5。 次のステップでは、得られたアシル酵素が2番目の基質（ほとんどの場合はテトラペプチドステム）と反応して、4→3架橋されたテトラ-テトラ二量体を形成し、同時にPBPが放出されます（図1c;補足図）。 S1a)2. d,d-トランスペプチダーゼは、足場タンパク質やエンドペプチダーゼと協力して、拡張するPG網状高分子へのグリカン鎖の挿入を仲介し、それによって細菌の形状を決定し、細胞全体の細胞質の浸透圧に対する機械的障壁を確保します。サイクル3、4、5、6、7。

a エンベロープは内膜 (IM、灰色) と外膜 (OM、黒色) で構成されています。 ペプチドグリカン (PG、青) は細菌細胞の浸透圧保護を保証します。 IM は主にリン脂質 (PL) から構成される脂質二重層です。 OM は非対称脂質二重層です。内側のリーフレットは PL で構成され、外側のリーフレットはリポ多糖類 (LPS) と腸内細菌共通抗原 (ECAPGL) で置換されたホスファチジルグリセリドで構成されています。 b PG サブユニットの構造 (GlcNAc、N-アセチル-グルコサミン; MurNAc、N-アセチル-ムラミン酸)。 c PG は、短いペプチドステム (色付きの円) によって架橋されたグリカン鎖 (青紫色の多角形) で構成される網状の高分子です。 PBP は、アシル供与体ステムの 4 番目の位置を受容体の 3 番目の位置に接続する 4 → 3 架橋の形成を触媒します。 LDT ファミリーの 2 つのメンバー (YcbB および YnhG) は、3 → 3 架橋の形成を触媒します。 3 つの LDT (ErfK、YbiS、および YcfS) がブラウン リポタンパク質 (Lpp) を PG に固定します。 PGドナーステムの3番目の位置にあるDAPをLppのArg-Lys末端に連結すると、OMとPGの間に共有結合が形成されます。 PG-Lpp リンクは YafK LDT によって加水分解されます 46,47。 d セフトリアキソンなしで増殖させたBW25113株(ycbB、relA')からのムロペプチドのrpHPLCプロファイル。 構造は、MurNAc-GlcNAc β-1,4 結合を切断するムラミダーゼによる PG の消化によって得られた断片から推測されます。 e 質量分析分析から推定されたムロペプチドの構造。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

構造的に無関係な l,d-トランスペプチダーゼ (LDT) による PBP の d,d-トランスペプチダーゼ活性のバイパスにより、ほとんどの β-ラクタムに対する耐性が生じます 8,9。 l,d-トランスペプチダーゼは、テトラペプチドステムのl,d mesoDAP3-d-Ala4ペプチド結合を切断し、3→3架橋を形成します（図1c;補足図S1b）10。 1,d-トランスペプチダーゼファミリーの他のメンバーは、ブラウンリポタンパク質のPGへの固定に関与しています（補足図S1c）11。 ほとんどが不可解な l,d-トランスペプチダーゼ PG 重合経路の活性化は、in vitro で選択された Enterococcus faecium の β-ラクタム耐性変異体で最初に発見されました 12,13。 l,d-ペプチド転移は、病原性結核菌における PG 架橋の主なモードであり 14、β-ラクタム メロペネムに基づく第三選択化学療法の標的となりえます 15。 大腸菌では、この経路の活性化には、YcbB 1,d-トランスペプチダーゼ（LdtD）とグアノシン五リン酸または四リン酸（p）ppGpp アルロン8の両方の過剰産生が必要です。 その後、YcbB はリポ多糖類の輸送の欠陥を補うため、PG の維持に関与することが報告されました 16。

PBP の d,d-トランスペプチダーゼ活性は、1960 年代に β-ラクタムの主な標的として同定されました 17。 それにもかかわらず、細菌の死につながる下流のイベントのカスケードを解読することは、特別な課題を引き起こします18、19、20、21。 このテーマは依然として熱心な調査の対象となっています。

本研究では、β-ラクタム不活化されたPBPの4→3架橋活性をl,d-トランスペプチダーゼYcbBの3→3架橋活性によって救済するために不可欠な機能をゲノムスケールで研究する。 。 結果は、YcbB媒介β-ラクタム耐性に必須の遺伝子のTn-seq同定、エピスタティック関係を解読するための複数の遺伝子欠失の構築、および質量分析によるPGの構造の決定に基づいています（図1d、e）。 この分析は、細胞エンベロープの進化性、エンベロープポリマーの恒常性に関係する相互作用の複雑なネットワーク、およびβ-ラクタム媒介によって誘発されるストレスと戦うために大腸菌が発達する機構について、新たな窓を開きます。 d,d-トランスペプチダーゼの不活化。

トランスポゾン配列決定 (Tn-seq)22 アプローチを使用して、大腸菌 BW25113(ycbB, relA')8 のゲノムにおける YcbB 媒介 β-ラクタム耐性に必須の遺伝子を同定しました。 この株は、それぞれ、ycbBおよびrelA'遺伝子のIPTGおよびl-アラビノースによる誘導により、1,d-トランスペプチダーゼYcbBおよび(p)ppGppシンテターゼRelA'の高レベルの産生を組み合わせる。 2 つの実験条件、セフトリアキソンの不在 (-CRO) または存在 (+CRO) を比較しました。 この広域スペクトルの第 3 世代セファロスポリンは、PBP ファミリーに属するすべての d,d-トランスペプチダーゼを不活化するのに非常に効果的であり、l,d-トランスペプチダーゼは効果のないアシル化と加水分解を受けやすいアシル酵素の形成の組み合わせです23,24。 両方の条件について、YcbB l,d-トランスペプチダーゼおよびRelA' (p)ppGppシンターゼをそれぞれコードする遺伝子を誘導するために、IPTGおよびl-アラビノースを添加した。 810,000 (-CRO) および 260,000 (+CRO) の形質転換体のプールに対してゲノム DNA 抽出を実行し、配列を決定しました。 独立した DNA 抽出の技術的複製により、-CRO 条件と +CRO 条件でそれぞれ 0.90 と 0.94 の R2 相関係数が明らかになりました (図 2a、b)。 接合部を含む配列を大腸菌 BW25113 参照ゲノムとアラインメントし、挿入部分のギャップの存在を定量化することで必須遺伝子を同定しました (図 2c)。 遺伝子あたりの平均リード数を比較して、+CRO条件でトランスポゾン挿入が有意に（p値<0.05）過小評価された遺伝子を特定しました（図2d;補足データファイル1a）。

a、b それぞれ -CRO 条件と +CRO 条件で得られた 2 つのシーケンスされたテクニカル レプリケートの CDS あたりの正規化された平均リード数の相関。 c トランスポゾン挿入の頻度と位置。 リングは、最も外側から最も内側まで、以下に対応します。(i) BW25113 座標。 (ii) センス (ライトグレー) およびアンチセンス (グレー) CDS。 (iii) -CRO 対 +CRO 条件における挿入の変化倍数の log2。 -CRO と +CRO の比率が 1 より小さい場合と大きい場合のデータは、それぞれ黄色と紫で表示されます。 (iv) +CRO 条件に特に必須のセンス CDS とアンチセンス CDS。 d 火山プロットは、+CRO 条件でトランスポゾンの不活化が有益または有害である遺伝子を表します。 X 軸は、-CRO 条件と +CRO 条件の遺伝子ごとの平均リードの変化倍数の log2 を表します。 Y 軸は、対応のない両側 t 検定から得られた p 値の負の log10 を表します。 ピンク色の領域は、+CRO 条件で挿入数が少なくとも 4 分の 1 少ない遺伝子に対応し、p 値 < 0.05 です。 e +CRO 状態において特に不可欠な遺伝子の生物学的機能。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

Tn-seq 解析により、(i) トランスポゾン挿入におけるギャップの存在、(ii) 有意な p-値 (< 0.05)、および (iii) 倍率変化が 4 より大きい (「方法」を参照) (補足データ ファイル 1b)。 -CRO 条件において選択的に必須である遺伝子は見つかりませんでした。 179個の+CRO選択的必須遺伝子は7つの機能カテゴリーに割り当てられ、その大部分はエンベロープ成分の代謝（N = 71、40％）およびストレス応答（N = 35、20％）に関与していることが判明しました（図2e） ）。 この研究で議論された遺伝子の関連する Tn-seq プロファイルは、補足データ ファイル 2 にまとめられています。

隔壁の合成は、FtsZ リングの組み立てによって細胞中央部で補充されるジビソームの構成要素によって媒介されます (図 3a)6。 コアジビソームのタンパク質、FtsA、FtsEX、FtsQLB、FtsW、FtsZ、ZipA、および PBP3 は、それぞれ -CRO 条件と +CRO 条件の両方で必須でした。 対照的に、ジビソーム関連タンパク質は、細胞周期の制御 (MinCD、FtsK)25,26、ストレス条件下でのジビソームの安定化 (FtsP)27,28,29、および細胞との物理的結合の提供に関与しています。外膜 (TolABQR および Pal)30 は +CRO 条件でのみ必須でした (補足データ ファイル 1b; 補足データ ファイル 2)。

a、b それぞれジビソームとエロンガソームの概略図。 c エロンガソームの構成要素をコードする遺伝子のTn-seq挿入プロファイル。 リーディングフレームはパネルの下部に示され、色分けされています。赤、+CRO に選択的に必須の遺伝子。 緑色、-CRO と +CRO の両方に必須の遺伝子。 灰色、遺伝子はどちらの状態でも必須ではありません。 トランスポゾン挿入部位は、読み取りフレームの上の線で示され、その高さは各挿入の読み取り数を反映しています。 d エロンガソーム構成要素PBP2およびRodAをコードする遺伝子の本質性を部位特異的突然変異誘発によって試験した。 播種効率は、それぞれ ycbB および relA' の誘導のために 40 μM IPTG および 1% l-アラビノースを補充した BHI 寒天プレート上で、8 μg/ml のセフトリアキソンの存在下 (+セフトリアキソン) または薬剤なし (-セフトリアキソン) でテストしました。 mrdA S330AおよびmrdA S330Cを有する株はセフトリアキソンの存在下では37℃では増殖しなかったため、プレートを28℃でインキュベートした。

ペプチドグリカンの側壁の拡張はエロンガソームによって媒介されます（図3b）。これには、（i）形状、伸長、分裂、および胞子形成（SEDS）タンパク質ファミリーに属するグリコシルトランスフェラーゼであるRodA、（ii）PBP2、 d,d-トランスペプチダーゼ活性を持つ触媒的に単官能性のクラスB PBP、および(iii) エロンガソーム複合体の足場細胞骨格を形成するアクチン様タンパク質であるMreB。

以前の分析により、エロンガソームは、(p)ppGpp アラームロンを過剰産生する変異体の増殖に必要ではないことが確立されました 31,32。 予想どおり、Tn-seq 分析により、6 つのエロンガソーム遺伝子 (mrdA、rodA、rodZ、mreB、mreC、および mreD) のそれぞれが、(p) の生成のための l-アラビノースを含む -CRO 条件での増殖に不可欠であることが示されました。 RelA'によるppGpp（図3c）。 エロンガソーム変異体の増殖は、relA' (p)ppGpp シンターゼ遺伝子の発現にさらに依存していました（補足図S2a）。 驚くべきことに、6つのエロンガソーム遺伝子は、(p)ppGppの産生にもかかわらず、+CRO条件ではそれぞれ必須でした（図3c）。 PBP2 (mrdA によってコードされる) の必須性は、この PBP がセフトリアキソンによる d,d-トランスペプチダーゼ ドメインの不活化により PG 架橋に直接関与できないことを考えると、予想外でした 8,33。 エロンガソームの構成要素は、隣接する遺伝子の転写レベルを変化させる可能性がある極性の影響に対して非常に敏感なコンパクトな遺伝子クラスターによってコードされています。 したがって、PBP2のトランスペプチダーゼ活性を損なうためのmrdAのワンステップ部位特異的突然変異誘発のためのCRISPR-Cas9アプローチ（補足図S2b）を使用して、Tn-seqの結果を補完しました。 セフトリアキソンに対する耐性の発現は、mrdAの欠失によって廃止されましたが、d,d-トランスペプチダーゼの触媒的Ser残基のAlaまたはCysによる置換によっては廃止されませんでした（図3d;補足図S2c）。 したがって、トランスペプチダーゼ活性ではなく、PBP2 が薬剤耐性に不可欠でした。

同様のCRISPR-Cas9アプローチをグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子rodAの突然変異誘発に適用したところ、セフトリアキソン存在下での増殖には触媒活性型のグリコシルトランスフェラーゼが必要であることが明らかになった（図3d、補足図S2c）。 PBP2、RodZ、MreB、MreC、および MreD はそれぞれエロンガソームの組み立てに必須であり、PBP2 と RodA の間の相互作用は PBP2 活性に依存しないことが以前に示されています 34,35,36。 したがって、YcbBによるPG架橋には、RodAとPBP2の両方を含む機能的エロンガソームにおけるRodAによるグリカン鎖の重合が必要であり、後者の酵素のトランスペプチダーゼ活性は不要である。

大腸菌では、PG の 40 ～ 50% が世代ごとに分解され、得られたムロペプチドの > 90% が細胞によって再利用されます 37,38。 これには、特殊な透過分解酵素、AmpG および Opp 複合体による PG フラグメントの細胞質への逆行性輸送と、それに続く糖部分とペプチド部分のそれぞれグルコサミンとトリペプチド l-Ala-γ-d-Glu-DAP としてのリサイクルが含まれます (図.4a)。 Tn-seq 分析により、AmpG パーミアーゼをコードする遺伝子と Opp 複合体の各成分が、-CRO 条件と +CRO 条件の両方での増殖に完全に不要であることが示されました。 さらに、両方のトランスポーターが失われたにもかかわらず、生存可能でセフトリアキソンに耐性があることが判明したΔampG ΔoppF ΔmppA 三重変異体を構築することにより、PG リサイクルが完全に不要であることを実証しました（補足図S3a）。 それにもかかわらず、細胞質1,d-カルボキシペプチダーゼLdcAは+CRO条件では必須であったが、-CRO条件では必須ではなかった(補足データファイル1b;補足データファイル2)。 この酵素は、リサイクルされたテトラペプチドステムから d-Ala4 を切り取って、Mpl リガーゼによって UDP-MurNAc に直接付加される I-Ala-γ-d-Glu-DAP トリペプチドを提供することが以前に示されています 39,40。 LdcAをコードする遺伝子の破壊は、定常増殖中に溶菌を引き起こすことが報告されており、これは、リサイクルされたテトラペプチドステムがd,d-トランスペプチダーゼによるアシル供与体として機能できないため、架橋が劇的に減少したことに起因します（補足図S1）。 YcbB はアシル供与体としてテトラペプチドステムを使用するため、同じ説明ではセフトリアキソン耐性における LdcA の本質的な役割を説明できません 8。 それにもかかわらず、+CRO条件におけるLdcAの本質的な役割は、mpl遺伝子の欠失によりセフトリアキソンの存在下でΔldcA変異体の増殖が回復したため、輸入されたテトラペプチドの排除に由来しました（補足図S3a）。 PG合成の最初に関与するステップを触媒する酵素をコードするmurAを過剰発現させると（図4a）、ΔldcA変異体の耐性も回復しました（補足図S3b）。 したがって、PG 集合経路を介した代謝フラックスを高めることで、輸入されたテトラペプチドの毒性が補われます。 まとめると、これらの結果は、Mpl がテトラペプチドを UDP-MurNAc 上に連結すること、および LdcA の非存在下では、得られるテトラペプチド含有前駆体がその後の PG 合成ステップで効果的に使用されず、経路の全体的な有効性が損なわれることを示しています。

a PG サブユニットは、de novo 合成 (左) と PG フラグメントのリサイクル (右) の両方によって組み立てられます。 b コラン酸ヌクレオチド糖前駆体の合成。 c ウンデカプレニル脂質担体に結合したコラン酸サブユニットの構築。 d コラン酸の重合と細胞表面への輸送。 略語: Ac アセチル; C55 ウンデカプレニル脂質担体。 IM内膜。 OM外膜。 リン酸P; ピルビン酸ピル。

l,l-DAP を mesoDAP に変換する DapF は、大腸菌の増殖には必要不可欠であると報告されています 41。 MurE リガーゼは、Km41 の 3000 倍の違いにより、mesoDAP の添加よりも効果的ではありませんが、UDP-MurNAc-1-Ala-d-Glu への 1,1-DAP の付加を触媒します。 DapF をコードする遺伝子を欠失させると、ペプチドグリカン前駆体に 1,1-DAP が組み込まれます。 1,1-DAP を含むステムペプチドは、PBP によってアシル供与体としては効果的に使用されませんでしたが、受容体としては使用されませんでした 41。 ペプチドグリカンの全体的な架橋結合は中程度に減少しました41。 一致して、1,1-DAP は、in vitro で精製 PBP1b によって mesoDAP に対して強く区別されました 42。 私たちの研究では、dapFは-CRO条件では必須ではありませんでした。 反対に、+CRO 条件ではこの遺伝子にトランスポゾン挿入は見つかりませんでした (補足データ ファイル 1b、補足データ ファイル 2)。 3→3架橋二量体の形成はΔdapF変異体で検出されましたが（補足図S4）、質量分析分析では2つのDAP立体異性体を区別できませんでした。 さらに、私たちのペプチドグリカン分析は、dapFの欠失がブラウンリポタンパク質のPGへの固定を妨げないことを示しました（補足図S4）。 したがって、1,d-トランスペプチダーゼは、PBPと同様に、dapFの欠失後のペプチドグリカン前駆体への1,1-DAPの取り込みをある程度許容した。 +CRO条件におけるdapFの本質性は、ldcAヌル変異体について上記で観察されたように、PG集合経路の有効性の低下によって説明される可能性がある。

dapFを除いて、単一の酵素によって実行されることが知られているPG生合成ステップに関与する酵素をコードするすべての遺伝子は、+CRO条件と-CRO条件の両方で必須であることが確認されました（図4a）。 冗長な酵素機能を含む必須の生合成ステップのデータは補足図S5に報告されています。

ほとんどの大腸菌株の細胞壁の最も外側のポリマーは、コラン酸でできたカプセルです43。 WcaJ は、コラン酸前駆体の組み立てにおける最初に関与するステップを触媒します。 WcaJをコードする遺伝子は、-CROおよび+CRO条件では必須ではなく、カプセルの不在がセフトリアキソンの非存在または存在の両方で成長に適合することを示しました（図4b〜d）。 予想外なことに、コラン酸合成経路の他のすべての酵素は、+CRO 条件では必須でしたが、-CRO 条件では必須ではありませんでした (補足データ ファイル 1b、補足データ ファイル 2)。 他のすべてのコラン酸生合成酵素が失われるとウンデカプレニル結合前駆体の蓄積が生じると予想されることを考慮すると、これらの酵素は脂質キャリアの隔離を防ぐために不可欠であると結論付けました。 このモデルによれば、C55 の隔離は、同じ脂質担体に依存する必須の PG などの他のポリマーの集合を間接的に阻害すると考えられます。 確認として、コラン酸前駆体合成の最初に関与したステップを触媒するWcaJをコードする遺伝子の欠失により、セフトリアキソンの存在下でWcaI変異体の増殖が回復することを示しました（補足図S6a）。 総合すると、これらの結果は、脂質キャリアの隔離によるPG合成の低下を防ぐためにコラン酸生合成酵素が必須であるが、カプセル自体はセフトリアキソン存在下での増殖に必須ではないことを示している。

3 つの ECA ポリマーは、同じ C55 結合前駆体から組み立てられます (図 5)44。 1 ～ 14 単位の前駆体で構成される ECA は、外膜の外側リーフレット内のリポ多糖類 (ECALPS) またはホスファチジルグリセリド (ECAPGL) に共有結合します。 4 つのユニットからなるフリーサイクリック ECA (ECACYC) はペリプラズムに位置します。

a ECAヌクレオチド-糖前駆体の合成。 b ウンデカプレニル脂質担体に結合した ECA サブユニットのアセンブリ。 c ECA の重合と細胞表面への輸送。 d コアLPSヌクレオチド-糖前駆体の合成。 e コア LPS の組み立て。 f LPS の細胞表面への輸送。 略語: C55 ウンデカプレニル脂質キャリア。 IM内膜。 OM外膜。 リン酸P。

ヌクレオチド-糖前駆体の合成（図5a）およびC55結合三糖サブユニットの構築（図5a）に関与する酵素をコードする遺伝子でトランスポゾン挿入が検出されたため、3つのECAポリマーはいずれも-CRO条件では必須ではありませんでした。 5b)。 対照的に、+CRO 条件ではほとんどの酵素が必須であり、3 つの ECA ポリマーのうちの少なくとも 1 つが耐性に必須であることを示しています (補足データ ファイル 1b; 補足データ ファイル 2)。 WaaLおよびWzzEリガーゼをコードする遺伝子の欠失は、単独または組み合わせで、セフトリアキソンの存在下での増殖には不要であったため、ECALPSとECACYCの両方の合成は耐性には不要でした（図5c;補足図S6b）。 二重変異体の表現型は、セフトリアキソン耐性について ECALPS と ECACYC の間に重複がないことを示しています。 消去法により、これらの結果は、対応するポリメラーゼがまだ同定されていないため、これを直接確立することはできないが、耐性には ECAPGL の合成が不可欠であることを示しています。

2 つの 3-デオキシ-d-マンノ-オクツロソン酸残基で置換されたリピド A は、大腸菌の増殖に必要な LPS の最小部分であることが知られています 45。 したがって、その合成と外膜への輸送に関与するほとんどの酵素は、-CROおよび+CRO条件で必須でした（図5d–f）。 下流の酵素は、ADP-1-グリセロ-d-マンノ-ヘプトース サブユニット (RpiA、Rpe、GmhA、HldE、GmhB、および HldD) の合成、糖鎖への d-マンノ-ヘプトースの付加 ( WaaC)、およびこの残基のリン酸化 (WaaP) は、+CRO 条件でのみ必須でした。 2 番目の d-マンノ-ヘプトース (WaaF) および d-グルコース (WaaG) 残基の付加も耐性には必須でした (補足データ ファイル 1b; 補足データ ファイル 2)。 +CRO条件での最適な増殖には、外側コアの組み立てにおけるその後の3つのステップ（WaaQ、B、およびR）を触媒する酵素が必要でした。 この経路の 3 つの酵素 (WaaY、J、および U) のみが、-CRO 条件と +CRO 条件の両方で完全に不要でした。 これらの結果は、セフトリアキソンの存在下での増殖が LPS の不完全な合成と両立しないことを示しています。

スポットアッセイにより、+CRO 条件での増殖は、ストレスを受けた細胞によるコラン酸の過剰産生に起因することが知られている表現型であるムコイド表現型と関連していることが明らかになりました。 この観察は、+CRO条件(上記)におけるldcA、dapF、ECAPGL、およびLPSコア糖の必須性が、セフトリアキソンに曝露された細菌によるコラン酸の過剰産生に依存する可能性があるという正式な可能性を提起する。 コラン酸合成が欠損したΔwcaJ株ではldcA、dapF、wecA、およびwaaCが依然として必須であったため、これは当てはまりませんでした（補足図S6c）。

大腸菌ゲノムは、LDTタンパク質ファミリーの6つのメンバーをコードしています（補足図S1）。 YcbB と YnhG は 3 → 3 架橋の形成を触媒しますが、ErfK、YbiS、および YcfS はブラウン リポタンパク質 (Lpp) を PG10,11 に共有結合する役割を果たします。 残りの酵素 YafK は、ErfK、YbiS、および YcfS によって形成された Lpp-PG リンクを加水分解し、それによってリポタンパク質を放出します 46,47。 Tn-seq 分析は、ブラウン リポタンパク質が -CRO 条件と +CRO 条件の両方での増殖に不可欠であることを示しました。 PG構造の分析により、セフトリアキソンの存在下での増殖により、ブラウンリポタンパク質のPGへの固定が劇的に減少することが明らかになりました（補足図S7）。 ウェスタンブロット分析は、+CRO条件ではLpp合成が減少しないことを示しました（補足図S7g）。 したがって、セフトリアキソンはLDTによって触媒されるアンカー反応を阻害する可能性がありますが（補足図S1）、LDTはカルバペネムクラスに属するものを除いてβ-ラクタムによって効果的に阻害されないため、この阻害は直接的である可能性は低いです23,24。

β-ラクタムによるPGへのLppアンカーリングの阻害モードに関する仮説は、PG架橋（YcbBおよびYnhG）およびLppアンカーリング（ErfK、YbiS、およびYcfS）用のLDTが同じものと相互作用するという事実を考慮する必要があります。 2種類のl,d-トランスペプチド反応に共通する最初の触媒ステップにおけるドナー基質、テトラペプチドドナーステム（補足図S1b、S1c）12。 第 2 ステップでは、得られたアシル酵素がペプチドグリカン ステムと反応して 3→3 架橋を形成するか、Lpp と反応してリポタンパク質を PG に共有結合させます。 ペプチド転移反応の最初のステップの共通の基質は、以前に提案されたように 47 、同じテトラペプチド供与体に対する LDT の競合が、PG へのブラウン リポタンパク質の固定の制限に寄与する可能性があることを示唆しています。 ただし、+CRO条件における3→3架橋の高い割合（40％）はLppの固定に有害ではなかったため、これはYcbB媒介セフトリアキソン耐性の文脈ではありそうもないように見えます（補足図S7）。 したがって、セフトリアキソンの存在下でのLppアンカリングの障害は、パートナー酵素によるテトラペプチド基質の形成や、ErfK、YbiS、およびYcfSの活性に対するセフトリアキソンの別の間接的な阻害効果から生じる可能性があります。 YafKによるリポプロテイン。

セフトリアキソンの存在下での外膜の完全性に対する外膜成分の役割を評価したので、我々の次の目的は、透過性バリアとしてのその機能を決定することでした。 ycbBおよびrelA'の誘導因子の非存在下では、細胞質LacZ β-ガラクトシダーゼによるクロロフェノールレッド-β-d-ガラクトピラノシド（CPRG）の加水分解が、セフトリアキソン阻害ゾーンの周囲の狭いリングで検出されました（図6a）。 。 したがって、CPRGには特異的なトランスポーターが存在しないため、薬物の最小発育阻止濃度(MIC)に近い発育阻害濃度に曝露すると、透過性が増加する結果となった。 ycbB および relA' を誘導すると、広い領域で LacZ 活性が検出され、セフトリアキソンがその株の MIC よりもはるかに低い濃度で透過性を増加させることが示されました。 セフトリアキソンの存在下で増殖すると、細菌はドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に対して感作され、界面活性剤のMICが40分の1を超える減少をもたらしました（図6b）。 セフトリアキソンの存在下での増殖は、グラム陰性菌の外膜に浸透しにくいことが知られているバンコマイシン、モエノマイシン、バシトラシン、およびエリスロマイシンに対する感受性も増加させた（図6c）。 まとめると、これらのデータは、YcbB による PBP のバイパスがセフトリアキソンの存在下での外膜の透過化と関連していることを示しています。 これは、β-ラクタムの作用機序には、薬物の標的への結合により薬物のペリプラズムへのアクセスが促進されるポジティブループが関与している可能性があることを示唆しています。 脂質過酸化の増加が比色アッセイによって検出されたため、活性酸素種（ROS）によって媒介される外膜への損傷がこのプロセスに関与している可能性があります（補足図S7h）。

a 細胞質 LacZ63 による 20 μg/ml の発色性 CPRG の加水分解。 ディスクには 30 µg のセフトリアキソンがロードされました。 b SDS 存在下でのめっき効率。 増殖は、ycbB および relA' の誘導のために 40 μM IPTG および 1% l-アラビノースを添加した BHI 寒天プレート上で、8 μg/ml のセフトリアキソンの存在下 (+セフトリアキソン) または薬物の非存在下 (-セフトリアキソン) でテストされました。 、 それぞれ。 c 野生型大腸菌の外膜を透過しない薬物の阻害直径。 値は 3 つの生物学的リピートの中央値です。 d β-ラクタムによるPBPの不活性化による細菌細胞死につながる一連の事象。 e YcbB l,d-トランスペプチダーゼによるPBP不活化の回復。 略語: IM 内膜。 OM外膜。 Lppブラウンリポタンパク質; OMP 外膜タンパク質。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

β-ラクタムの標的とその不活化のメカニズムは何十年も前から知られていますが、細菌細胞死につながる下流の一連の現象についてはまだ十分に理解されていません。 最新のモデル（図6d）は、PBPの不活化によりペリプラズムでの非架橋グリカン鎖の生成と、その後の溶解酵素による切断が起こると提案しています19,21。 このPG合成と分解の無駄なサイクルによって生成される同化要求は、中心炭素代謝、タンパク質合成、ATP利用の変化を引き起こし、DNA、RNA、タンパク質、脂質などの生体分子に損傷を与えるROSの産生につながります。 結果として生じる酸化ストレスは細胞死に寄与します18,48。

YcbB による PBP 不活化の救済は、最も単純な意味では、4 → 3 を 3 → 3 架橋に置き換えることによる PBP の架橋活性のバイパスを意味します (図 1)。 しかし、我々の分析は、YcbBによるd,d-トランスペプチダーゼ活性の回避にもかかわらず、PBPの不活化による毒性効果が持続したため、β-ラクタム耐性がかなり複雑であることを示しています。 一致して、+CRO条件では脂質過酸化の増加が検出されました（補足図S7h）。 +CRO条件で選択的に必須であると同定された遺伝子（図2;補足データファイル1b）は、これらの毒性影響を軽減するために動員される機能の複雑さを明らかにしました（図6e）。

β-ラクタムによるこの PBP の不活化による PBP2 媒介ペプチド転移からの RodA 媒介糖転移の共役解除は、感受性細菌と耐性細菌の生存率に逆の効果をもたらすことが以前に示されています。 感受性細菌では、β-ラクタムによる PBP2 不活化後の未架橋グリカン鎖の蓄積は有害であり、溶解性トランスグリコシラーゼ SltY によるそれらの分解が細胞の生存に寄与します 21。 対照的に、SltY の不活化は、エロンガソーム複合体によって形成される非架橋グリカン鎖が機能的 PG ポリマーの構築に適した基質として機能するため、YcbB を介したβ-ラクタム耐性が促進されます7。 パルス標識実験により、YcbB は、(i) 3 → 3 架橋グリカン鎖の集合、その後の (ii) 得られた新規合成ポリマーの既存の PG49 への挿入を含む 2 段階のメカニズムを介して PG 重合をサポートしていることが示されました。 本研究では、このペプチドグリカン重合様式には機能的なエロンガソームが必要であり、触媒活性のある RodA によるグリカン鎖重合をサポートしているという直接的な証拠を提供します (図 3)。

+CRO 条件では PG リサイクルが促進されます 49。 これは、YcbBによるPBPの救済は、薬物の存在下でPG構築経路に供給するために必要な高い同化要求を減少させるが、廃止するわけではないことを意味します。 今回我々は、PG集合経路における前駆体の代謝フラックスの減少は、YcbBを介したβ-ラクタム耐性と両立しないことを示す。 これは、dapF欠失またはldcA欠失の場合に当てはまることが観察され、それぞれ1,1-DAPまたはテトラペプチドステムを含む異常な前駆体の合成につながりました（図4a）。 これは、PG合成に競合的に使用されるウンデカプレニル脂質キャリアの隔離につながるコラン酸合成酵素をコードする遺伝子の不活化にも当てはまりました（図4b-d）。 アナボリック需要の残留過剰も、PG合成の有効性と直接関係しない結果をもたらす可能性があります。 実際、同化需要の上昇は、ROS 産生が上昇したままであることを意味します。 結果として生じる酸化ストレスに対する防御の成功は、高分子の修復に関与する調節因子、シャペロン、酵素の選択的に重要な役割を説明している可能性があります（図2e;補足データファイル1b）。

驚いたことに、耐性はECAPGL（図5a）、完全なコア糖を含むLPS（図5b〜d）、Tol-Palシステムの構成要素（図3a）、および以下を含む外膜タンパク質にも依存することがわかりました。 OmpA および OmpC (補足データ ファイル 1b、補足データ ファイル 2)。 最近、細菌の形態解析により、外膜が細胞エンベロープの機械的特性に直接寄与していることが示され、その役割は歴史的には PG 層のみに起因すると考えられていました 50,51。 驚くべきことに、これらの以前の報告の1つで特定された外膜の剛性に不可欠な安定化成分50には、完全なコア糖を有するLPS、Tol-Palシステム、およびYcbB媒介セフトリアキソン耐性に必須であることがここで特定されたOmpAが含まれていた。 したがって、セフトリアキソンの存在下での機能的エンベロープの構築には、YcbBのl,d-トランスペプチダーゼ活性によるPBPのd,d-トランスペプチダーゼ活性のバイパスと、外膜への重要なポリマーの挿入の両方が必要であった。

結論として、ゲノムワイドな Tn-seq スクリーニングと組み合わせた YcbB による PBP のレスキューにより、β-ラクタムの 2 つの予期せぬ影響が明らかになりました。 まず、セフトリアキソンへの曝露により、1,d-トランスペプチダーゼを介したブラウンリポタンパク質のPGへの固定が妨げられました（補足図S7）。 第二に、セフトリアキソンへの曝露により外膜の透過性が増加しました（図6）。 後者の効果は、外膜を通過する自己促進的な浸透が、β-ラクタムの作用機序のこれまで認識されていなかった側面であることを意味します。 さらに、我々のデータは、β-ラクタム誘発の無駄なサイクルが持続可能であるのは、ペプチドグリカン集合経路の有効性が、非効率な生合成ステップによって、または共通のウンデカプレニル脂質担体に依存する他のポリマーの集合との競合によって損なわれない場合にのみ持続可能であることを示している。 YcbB によって架橋された PG は機能しましたが、細胞エンベロープの完全性は外膜ポリマーに大きく依存しており、外膜ポリマーは成長に不可欠でした。 したがって、YcbBによるPBPのレスキューに関与する遺伝子の同定は、β-ラクタムによる細菌の死滅を防ぐ細菌反応を同定するための陽性スクリーニングを提供した。 対照的に、感受性細菌に限定された代謝分析は、抗菌薬に特有の摂動と細胞死に関連する多数の副作用の間の差異に鈍感です19。 したがって、我々の分析は、外膜が透過性バリアとしてのよく知られた役割52を超えて、β-ラクタムの作用機序およびl,d-トランスペプチダーゼ媒介β-ラクタム耐性において重要な役割を果たしているという説得力のある証拠を提供する。さまざまな細菌種でこれらの薬剤に対する耐性が以前に発見されている53、54、55、56。 次に、私たちの分析は、耐性菌に対するβ-ラクタムの有効性を高めるための潜在的な実行可能な標的を特定します。

研究で使用されたプラスミドと株の特徴と起源は、補足表S1にリストされています。 細菌をブレイン ハート インフュージョン (BHI; Difco) 寒天またはブロス中で通気 (180 rpm で振盪) しながら 37 °C で増殖させました。 50 μg/ml のカナマイシンを、Keio コレクションから入手した KmR カセットを保持する形質導入体の選択に使用しました。 増殖培地には、プラスミド喪失を逆選択するための薬物を全身的に補充した：プラスミドpKT2には10μg/mlのテトラサイクリン、pKT8には20μg/mlのクロラムフェニコール、pHV30および誘導体には25μg/mlのゼオシン。 Ptrc、ParaBAD、および PrhaBAD プロモーターの誘導は、それぞれイソプロピル β-d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG、40 μM)、l-アラビノース (1%)、および l-ラムノース (0.2%) を使用して実行されました。 この研究で構築したプラスミドは、特に指定しない限り、NEBuilder HiFi DNA アセンブリ (New England Biolabs) 法を使用して取得しました。 特定の遺伝子の欠失は、Keio コレクションから選択された変異体の KmR カセットの P1 形質導入によって得られました 57,58。 複数の遺伝子欠失の場合、プラスミド pCP20 によってコードされる FLT リコンビナーゼによって KmR カセットが除去されました。

大腸菌BW25113 ΔrelA pKT2(ycbB) pKT8(relA')の新鮮なコロニーを、10μg/mlのテトラサイクリンおよび20μg/mlのクロラムフェニコールを補充した10mlのBHIブロス中で増殖させた。 600 nm での光学濃度 (OD600nm) は約 600 nm です。 ０．８の細胞を遠心分離により収集し、４℃で１０ｍｌのＨ２Ｏで４回洗浄した。 100 μl のエレクトロコンピテントセルと 1 μl の EZ-Tn5 トランスポソーム® (Lucigen) を使用して、複数のエレクトロポレーション (以下を参照) を実行しました。 各エレクトロポレーションでは、形質転換細胞を、10 μg/ml テトラサイクリンおよび 20 μg/ml クロラムフェニコールを補充した 2 ml の BHI ブロス中で 37 °C で 1 時間インキュベートしました。 細胞を、8μgの非存在下（条件-CRO）または存在下（条件+CRO）で、50μg/mlカナマイシン、40μM IPTG、および1％l-アラビノースを補充した20枚のBHI寒天プレート（プレートあたり100μl）にプレーティングした。 /ml セフトリアキソン。 プレートを37℃で16時間（条件-CRO）または24時間（条件+CRO）インキュベートしました。 ２０％グリセロールを含むＢＨＩブロス４ｍｌで廃棄し、続いて同じ培地４ｍｌでプレートをさらに洗浄することによる２段階で、２０枚のプレートのセット（同じエレクトロポレーションに相当）から細胞を回収した。 各エレクトロポレーションで得られた細菌懸濁液は、-80 °C で保存されました。 -CRO 条件では、7 回のエレクトロポレーションで合計 810,000 CFU が得られました。 +CRO 条件では、10 回のエレクトロポレーションで合計 260,000 CFU が得られました。

DNA 抽出の場合、7 回 (-CRO 条件) または 10 回 (+CRO 条件) のエレクトロポレーションで得られた細菌懸濁液 10 μl をプールしました。 DNA 抽出は、Wizard Genomic DNA purification kit (Promega) を用いて 2 回実行し、テクニカルリピートを取得しました。

DNA ライブラリーの調製と Illumina の配列決定は、Viroscan3D 社とリヨン第一大学の ProfileXpert プラットフォームによって実行されました。簡単に説明すると、DNA を断片化し (約 300 bp)、P5 Illumina アダプターを断片化した DNA に連結しました。 EZ-Tn5の両側の接合断片は、5'末端にP7イルミナアダプターを有するTn5ハイブリダイゼーションプライマーHV1またはHV2と組み合わせて標準的なP5イルミナプライマーを使用して増幅されました（補足表S1）。 インデックスは、Tn left または Tn right プライマーによって保持されていました。 Illumina シーケンスは、NextSeq Mid Output 150 bp (ペアエンド: 40 ～ 110) で実行されました。 リードの逆多重化とトリミングは、大腸菌 BW25113 参照ゲノム (NCBI アクセッション番号: CP009273) とのアラインメントの前に実行されました。

分析は、Python (v.3.7) パッケージ TRANSIT (v.3.0+) を使用して実行されました59。 TPP コンポーネントは、生の実験読み取りを処理し、ダウンストリーム分析用の WIG ファイルを生成するために使用されました。 EZ-Tn5挿入部位を有するイルミナのペアエンドリードは、各リードのヌクレオチド25と50の間の予想される「TAAGAGACAG」トランスポゾン末端配列を有するものを最初に選択することによって同定された。 110 bp 逆配列 (アダプター P7 配列決定プライマー) は、EZ-Tn5 配列とゲノム配列の両方を含むため、すべての場合に使用されました。 次に、EZ-Tn5 リードは、BWA (v.0.7.17)60 を使用して大腸菌 BW25113 参照配列にマッピングされました。 左右のジャンクションに対応する結合された WIG ファイルが実験ごとに生成されました。 トランスポゾン挿入イベントは、FASTA ゲノム配列に対応する GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) GFF3 ファイルを使用して、特定のオープン リーディング フレーム/遺伝子に割り当てられました。 ORF/遺伝子ごとのインサート数の正規化は、Trimmed Total Reads (TTR) によって実行されました。リード カウントの上位と下位 5% をトリミングした後に正規化された合計リード カウントです。 平均挿入数は各実験条件に対して計算されました: 2 つの実験のそれぞれからの左および右ジャンクションの平均。

接合フラグメントは大腸菌 BW25113 参照ゲノムに合わせて整列され、TRANSIT パイプラインの Tn5Gaps アルゴリズムを使用して必須遺伝子が呼び出されました (補足データ ファイル 1a)59。 +CRO条件における選択的に必須の遺伝子のセットは以下によって構築された：（1）+CROの2つの複製では必須であり、-CROの2つの複製では必須ではない遺伝子の同定（サブセット1）。 （２）技術的重複の間で１つの不一致を有する遺伝子を追加する。例えば、１つの＋ＣＲＯデータセットにおいて非必須としてマークされ、または１つ​​の−ＣＲＯデータセットにおいて必須としてマークされる（サブセット２）。 （3）+CRO条件で有意に（p値<0.05）過小評価されているトランスポゾン挿入を特定するために、遺伝子あたりの平均リードを計算しました（補足データファイル1a）。 p 値 > 0.05 または倍率変化 < 4 をもたらしたサブセット 1 および 2 の遺伝子は除外されました。 得られた 179 遺伝子のセットは補足データ ファイル 1b にリストされています。 +CRO 条件で選択的に必須の遺伝子を含む経路または遺伝子クラスターについては、+CRO 条件で挿入数が大幅に減少している非必須遺伝子も考慮しました (p < 0.05)。 これらの遺伝子は適応コストを負担するとみなされました。

mrdA (GTCTACAGTTAAACCCTATG) および robA (GGTGGCTGCACAGCCTGACC) を標的とする 20 ヌクレオチドのガイド配列を、プライマー HV3 および HV4 または HV5 および HV6 (補足表 S1) を使用した逆方向 PCR 増幅によってプラスミド pTargetF61 に独立して導入し、pTargetF-mrdA および pTargetF-rodA を生成しました。 、 それぞれ。 簡単に説明すると、pTargetFをPhusion DNAポリメラーゼ(Thermo Scientific)を用いたPCRによって増幅し、PCR産物をDpnI制限酵素(Thermo Scientific)によって消化し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。 精製した PCR 産物をリン酸化し、ワンポット反応で T4 ポリヌクレオチド キナーゼおよび T4 DNA リガーゼ (Thermo Scientific) と連結し、得られた pTargetF-mrdA および pTargetF-rodA プラスミドをエレクトロポレーションによって大腸菌 TOP10 に導入しました。

mrdA S330A、mrdA S330C、rodA D159A、rodA D159N、ΔmrdA、およびΔrodA ドナー DNA を GeneCust によって合成し、pUC57 にクローニングしました。 点突然変異の導入に使用されるドナー DNA は、目的のコドンにミスセンス突然変異があり、遺伝子の染色体コピー上で Cas9 を誘導するために使用される 20 ヌクレオチドに対応する配列にサイレント突然変異を持つ mrdA または RodA の配列に対応します（その後の変異を防ぐため）。対立遺伝子交換後の Cas9 による切断)。 欠失を導入するために使用されるドナー DNA は、mrdA または RodA の上流 100 bp、最初の 6 コドン、最後の 8 コドン、および下流 100 bp の配列に対応します。 ドナーDNAは、Phusion DNAポリメラーゼ（Thermo Scientific）および補足表S1に示すプライマーHV7〜HV14を使用したPCRによって独立して増幅されました。 PCR産物をDpnI制限酵素(Thermo Scientific)で消化し、アガロースゲル電気泳動で精製した。

Jiang Y. et al.61 を参考にした方法。 大腸菌 BW25113 ΔrelA pKT8(relA') pCas の新鮮なコロニーを、1% l-アラビノースを補充した BHI ブロス 10 ml 中で撹拌しながら 30 °C で増殖させ、relA' と λ Red システムの両方の発現を誘導しました。プラスミドの損失を逆選択するために、20 μg/ml クロラムフェニコールおよび 50 μg/ml カナマイシンを使用します。 OD600nmで約 ０．８の細胞を遠心分離により収集し、４℃で１０ｍｌのＨ２Ｏで４回洗浄した。 プラスミド pTargetF-mrdA とドナー DNA mrdA S330A、mrdA S330C または ΔmrdA、またはプラスミド pTargetF-rodA とドナー DNA robA D159A、rodA D159N または ΔrodA を用いて、5000 ドナー DNA に対して 1 プラスミドの分子比で細菌をエレクトロポレーションしました。分子。 形質転換細胞を、1% l-アラビノース、20 μg/ml クロラムフェニコール、および 50 μg/ml カナマイシンを添加した 1 ml の BHI ブロス中で 30 °C で 2 時間インキュベートしました。 細菌を、1% l-アラビノース、50 μg/ml カナマイシン、および 120 μg/ml スペクチノマイシンを添加した BHI 寒天上に播種し、30 °C で 24 時間インキュベートしました。 pTargetF-mrdA または pTargetF-rodA を除去するために、pTargetF プラスミドを標的とする pCas にコードされた sgRNA の誘導用に 500 μM IPTG を追加した同じ培地で形質転換体を単離し、30 °C で 24 時間インキュベートしました。 染色体の欠失または点突然変異は、PCR およびサンガー配列決定によって検証されました。 熱感受性 pCas プラスミドを除去するために、予想される変異を含むクローンを 1% l-アラビノースおよび 500 μM IPTG を添加した BHI ブロス中で 37 °C で 6 時間増殖させ、1% l-アラビノースを添加した BHI 寒天培地上で単離しました。 37℃で16時間。 単離されたクローンを、1% l-アラビノースを添加した BHI ブロス中で 37 °C で 6 時間継代培養し、1% l-アラビノースを添加した BHI 寒天上で 37 °C で 16 時間単離しました。 スペクチノマイシン (pTargetF 誘導体の喪失) およびカナマイシン (pCas の喪失) に対する単離されたクローンの感受性を試験して、これらのプラスミドの喪失を確認しました。

細菌を対数増殖期後期、すなわちOD600nm 1.0～4.0まで増殖させた(激しく振盪しながら37℃で約6時間)。 OD600nmを1.0に調整し、10倍希釈物(10-1〜10-5)をBHIブロスで調製した。 得られた細菌懸濁液 5 μl を、図の凡例に示すように、誘導物質と薬物を補充した BHI 寒天プレート上にスポットしました。 ディスク拡散アッセイでは、OD600nm 1.0 の細菌懸濁液 5 μl を水 5 ml に接種しました。 BHI寒天プレートを後者の懸濁液で満たし、過剰な液体を除去し、抗生物質を含む紙ディスクを添加する前に、プレートを室温で15分間維持した。 クロロフェノールレッド-β-d-ガラクトピラノシド（CPRG）アッセイでは、親株BW25113はlacZの染色体コピーを発現しないため、pHV30bis（lacZ）を保有する株BW25113（ycbB、relA'）を使用しました。 37℃で16時間（セフトリアキソンを含むプレートの場合は24時間）インキュベートした後、プレートを画像化するか、阻害直径を測定しました。 図に示されているデータは、少なくとも 2 つの生物学的反復の代表であり、測定された阻害直径は 3 つの生物学的反復の中央値です。

細菌をBHIブロス中で対数期後期まで、すなわちOD600nmが1.0を超えるまで増殖させた(撹拌下、37℃で約6時間)。 得られた細菌懸濁液 10 μl を、誘導物質 (40 μM IPTG および 1% l-アラビノース) および薬物 (10 μg/ml テトラサイクリンおよび 20 μg/ml クロラムフェニコール、または 8 μg/ml セフトリアキソン) を補充した BHI 寒天上にプレーティングしました。 十分な量の細菌を得るために、各複製について 5 枚の BHI 寒天プレートを使用しました。 プレートを37℃で16時間（セフトリアキソンを含むプレートの場合は24時間）インキュベートしました。 細菌は、各プレートを１ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２で廃棄し、続いて１ｍｌのＰＢＳでプレートをさらに洗浄することによる２段階で回収した。 細菌を、最終体積２０ｍｌの４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を補充した０．５×ＰＢＳ中で１時間煮沸した。 球菌を遠心分離（20,000×g、20℃で20分間）によって回収し、20mlの水で5回洗浄し、1mlの20mM Tris-HCl pH7.5に再懸濁し、100μg/mlのプロナーゼとともに37℃でインキュベートした。 ℃で16時間。 球形嚢を1 mlの水で5回洗浄し、1 mlの20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0に再懸濁し、100 μg/mlのトリプシンとともに37℃で16時間インキュベートした。 球形嚢を1 mlの水で5回洗浄し、5分間煮沸し、遠心分離によって回収し、300μlの水に再懸濁し、-20℃で保存した。

10μlの精製嚢胞を、40mM Tris-HCl pH 8.0中の120μMリゾチームを用いて37℃で16時間消化した。 微量遠心機で20,000×gで10分間遠心分離して不溶性物質を除去し、ムロペプチドを含む可溶性画分を125mMホウ酸緩衝液pH9.0中の水素化ホウ素ナトリウムで室温で1時間還元した。 リン酸を使用してpHを4.0に調整した。 ムロペプチドは、C18 カラム (Hypersil GOLD aQ; 250 × 4.6 mm; 3 µm、Thermo Scientific) を使用し、流速 1 ml/min、直線勾配 (0 ～ 20%) を 10 ～ 60 分間適用して rpHPLC によって分離されました。 (バッファー A、TFA 0.1%、バッファー B、アセトニトリル 99.9%、TFA 0.1%、v/v)。 吸光度を205nmで監視し、画分を収集し、凍結乾燥し、水に再懸濁して、質量分析法で分析した。 質量スペクトルは、ポジティブモードで動作する Bruker Daltonics maxis 高分解能質量分析計 (ブレーメン、ドイツ) (フランス、パリ、国立自然史博物館の分析プラットフォーム) で取得しました。 質量スペクトル データは、mineXpert262 を使用して調査されました。

BW25113(ycbB, relA')は、球形嚢の調製のために行われたように、BHI寒天プレート中で-CROおよび+CRO条件で増殖させた。 細菌を 4% SDS を用いて 96 °C で 45 分間溶解しました。 粗細菌抽出物をSDS-PAGEによって分離した。 ＬｐｐおよびＲｐｏＡ（ローディングコントロールとして使用）は、それぞれＪＦ ＣｏｌｌｅｔおよびＣ．Ｂｅｌｏｉｎによって提供されたポリクローナルウサギおよびマウス抗体を用いて検出された。 一次抗体は 1/10,000 (v/v) に希釈しました。 PierceTM ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) の製造元の指示に従って、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体 (Sigma) および抗マウス抗体 (Sigma) を使用して検出を実行しました。 二次抗体は 1/2000 (v/v) に希釈しました。

BW25113(ycbB, relA') を、40 μM IPTG および 1% l-アラビノースを補充した BHI ブロス中で 37 °C で増殖させ、それぞれ ycbB および relA' の発現を誘導しました。 OD600nmで約 ０．２５のセフトリアキソンを添加し、インキュベーションを２時間続けた。 細菌（１ｍｌ）を採取し、溶解し、脂質過酸化ＭＤＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）の製造業者の指示に従ってマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の濃度を測定した。

Tn-seq解析の場合、再現性は、-CROおよび+CRO条件で得られた2つの配列決定された技術的複製のCDSあたりの正規化された平均リード数の相関によって対処されます（図2a、b）。 Tn-seq データの統計的処理については、「方法」セクションの「遺伝子の必須性と適合コストの決定」という見出しで説明されています。 p値は、対応のない両側t検定から得られました。 プレーティング効率アッセイでは、少なくとも 2 つの生物学的反復を実行しました (図のデータは 1 つの代表的な実験に由来します)。 rpHPLC および質量分析によるペプチドグリカン分析では、3 つの独立した生物学的反復を実行しました (図のデータは 1 つの代表的な実験に由来します)。 抗生物質感受性試験データは、3 つの独立した生物学的リピートからの中央値です。 ウェスタンブロット分析の場合、画像は 3 つの生物学的反復を表す 1 つです。 マロンジアルデヒド (MDA) の濃度は、3 つの生物学的反復からの平均値と標準偏差です。 p値は、対応のない両側t検定から得られました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された Tn-seq データは、アクセッション コード PRJNA907050 でシーケンス リード アーカイブ データベース (SRA) に保管されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

Turner, RD、Vollmer, W. & Foster, SJ ロッドとボールの異なる壁: ペプチドグリカンの多様性。 モル。 微生物。 91、862–874 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Sauvage, E.、Kerff, F.、Terrak, M.、Ayala, JA & Charlier, P. ペニシリン結合タンパク質: ペプチドグリカン生合成における構造と役割。 FEMS 微生物。 改訂 32、234–258 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

バンザフ、M.ら。 外膜リポタンパク質 NlpI は、大腸菌の多酵素複合体内のペプチドグリカン加水分解酵素の足場を担っています。 EMBO J. 39、e102246 (2020)。

Singh, SK、SaiSree, L.、Amrutha, RN & Reddy, M. 3 つの重複するムレイン エンドペプチダーゼが、大腸菌 K12 のペプチドグリカン合成における必須の切断ステップを触媒します。 モル。 微生物。 86、1036–1051 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Vollmer, W. 細菌の増殖にはペプチドグリカン加水分解酵素が必要です。 モル。 微生物。 86、1031–1035 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Egan, AJF、Errington, J. & Vollmer, W. ペプチドグリカンの合成とリモデリングの制御。 ナット。 Rev.Microbiol. 18、446–460 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Voedts、H.ら。 大腸菌における代替架橋酵素を介したペプチドグリカン合成におけるエンドペプチダーゼの役割。 EMBO J. 40、e108126 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Hugonnet、JE et al. 大腸菌における l,d-トランスペプチダーゼ媒介ペプチドグリカン架橋と β-ラクタム耐性に必須の因子。 Elife 5、e19469 (2016)。

マイナルディ、JL et al. Enterococcus faecium における dd-ペプチド転移のバイパスによるベータ-ラクタム耐性の新規メカニズム。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 275、16490–16496 (2000)。

記事 CAS Google Scholar

Magnet, S.、Dubost, L.、Marie, A.、Arthur, M. & Gutmann, L. 大腸菌におけるペプチドグリカン架橋のための l,d-トランスペプチダーゼの同定。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 190、4782–4785 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Magnet, S. et al. ブラウン リポタンパク質の大腸菌ペプチドグリカンへの結合に関与する l,d-トランスペプチダーゼの同定。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 189、3927–3931 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Mainardi, JL、Villet, R.、Bugg, TD、Mayer, C. & Arthur, M. グラム陽性菌における抗生物質の選択圧下でのペプチドグリカン生合成の進化。 FEMS 微生物。 改訂 32、386–408 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

マイナルディ、JL et al. β-ラクタム耐性ペプチド転移経路のための新規ペプチドグリカン架橋酵素。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 280、38146–38152 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

Lavollay, M. et al. 定常期の結核菌のペプチドグリカンには、主に l,d-ペプチド転移によって生成された架橋が含まれています。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 190、4360–4366 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Hugonnet, JE、Tremblay, LW、Boshoff, HI、Barry, CE & Blanchard, JS メロペネムクラブラン酸塩は、広範な薬剤耐性結核菌に対して効果的です。 サイエンス 323、1215–1218 (2009)。

記事 ADS CAS Google Scholar

モレ、N. et al. ペプチドグリカンのリモデリングにより、大腸菌は重度の外膜構築欠陥を生き延びることができます。 MBio 10、e02729-18 (2019)。

Izaki, K.、マツハシ, M. & Strominger, JL グリコペプチドトランスペプチダーゼおよび d-アラニンカルボキシペプチダーゼ: ペニシリン感受性酵素反応。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 55、656–663 (1966)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Hon, Y.、Zeng, J.、Wang, X.、Drlica, K.、Zhao, X. 活性酸素種によって媒介されるストレス後の細菌細胞死。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 116、10064–10071 (2019)。

記事 ADS CAS Google Scholar

マサチューセッツ州ロブリッツら。 同化異化プロセスによるエネルギー需要の増加により、β-ラクタム系抗生物質の致死性が高まります。 細胞化学。 バイオル。 29、276–286.e4 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

ロパトキン、AJ 他。 細菌の代謝状態は、増殖率よりも抗生物質による致死率をより正確に予測します。 ナット。 微生物。 4、2109–2117 (2019)。

記事 Google Scholar

Cho, H.、Uehara, T. & Bernhardt, TG ベータラクタム系抗生物質は、細菌の細胞壁合成機構の致死的な機能不全を誘発します。 セル 159、1300 ～ 1311 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Van Opijnen, T. & Camilli, A. トランスポゾン挿入シーケンス: 微生物のシステムレベル分析のための新しいツール。 ナット。 Rev.Microbiol. 11、435–442 (2013)。

記事 Google Scholar

Triboulet, S. et al. β-ラクタム抗菌活性にとって重要なl,d-トランスペプチダーゼ不活化の速度論的特徴。 PLoS One 8、e67831 (2013)。

記事 ADS CAS Google Scholar

マイナルディ、JL et al. β-ラクタムイミペネムによるEnterococcus faecium由来のペプチドグリカンld-トランスペプチダーゼの予期せぬ阻害。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 282、30414–30422 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Ramm, B.、Heermann, T. & Schwille, P. タンパク質パターンと勾配の制御における大腸菌 MinCDE システム。 細胞。 モル。 生命科学。 76、4245–4273 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Stouf, M.、Meile, JC および Cornet, F. FtsK は、大腸菌の姉妹染色体を積極的に分離します。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 110、11157–11162 (2013)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Samaluru, H.、Saisree, L. & Reddy, M. 大腸菌の細胞分裂における SufI (FtsP) の役割: ディバイソームの構築の安定化への関与の証拠。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 189、8044–8052 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Pichoff, S.、Du, S. & Lutkenhaus, J. 大腸菌における FtsN-FtsA 相互作用によって救出される二分体集合の破壊。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 115、E6855–E6862 (2018)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Truong, TT、Vettiger, A. & Bernhardt, TG 細胞分裂は、細胞伸長を促進するペプチドグリカン エンドペプチダーゼの活性によって拮抗されます。 モル。 微生物。 114、966–978 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Szczepaniak, J.、Press, C. & Kleanthous, C. グラム陰性菌における Tol-Pal の多様な役割。 FEMS 微生物。 改訂 44、490–506 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Vinella, D.、D'Ari, R. & Bouloc, P. ペニシリン結合タンパク質 2 は、ppGpp 合成が誘導される場合、大腸菌では不要です。 EMBO J. 11、1493–1501 (1992)。

記事 CAS Google Scholar

Vinella, D.、Joseleau-Petit, D.、Thevenet, D.、Bouloc, P. & D'Ari, R. 大腸菌におけるペニシリン結合タンパク質 2 の不活化は細胞分裂阻害を引き起こしますが、これは FtsZ の過剰発現によって緩和されます。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 175、6704–6710 (1993)。

記事 CAS Google Scholar

Kocaoglu, O. & Carlson, EE 大腸菌 DC2 株におけるペニシリン結合タンパク質に対する β-ラクタム選択性のプロファイリング。 抗菌。 エージェント・ケマザー。 59、2785–2790 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Rohs、PDA et al. 細菌細胞伸長機構によるペプチドグリカン重合の活性化における PBP2 の中心的な役割。 PLoS ジュネット。 14、e1007726 (2018)。

記事 Google Scholar

オズバイカル、G. et al. トランスペプチダーゼ PBP2 は、大腸菌における主要な細胞壁合成機構の初期局在と活性を制御します。 Elife 9、e50629 (2020)。

Liu, X.、Biboy, J.、Consoli, E.、Vollmer, W. & den Blaauwen, T. MreC および MreD は、エロンガソームタンパク質 PBP2 と RodA の間の相互作用のバランスをとります。 PLoS ジュネット。 16、e1009276 (2020)。

Jacobs, C.、Huang, LJ、Bartowsky, E.、Normark, S. & Park, JT 細菌細胞壁のリサイクルは、β-ラクタマーゼ誘導のエフェクターとしてサイトゾルのムロペプチドを提供します。 EMBO J. 13、4684–4694 (1994)。

記事 CAS Google Scholar

Johnson, JW、Fisher, JF & Mobashery, S. 細菌の細胞壁のリサイクル。 アン。 ニューヨークアカデミー。 科学。 1277、54–75 (2013)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Mengin-Lecreulx, D.、Van Heijenoort, J. & Park, JT UDP-N-アセチルムラメートをコードする mpl 遺伝子の同定：大腸菌における L-アラニル-ガンマ-d-グルタミル-メソ-ジアミノピメリン酸リガーゼとそのリサイクルにおける役割細胞壁ペプチドグリカンの一種。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 178、5347–5352 (1996)。

記事 CAS Google Scholar

Templin, MF、Ursinus, A. & Höltje, JV 細胞壁リサイクルの欠陥は、大腸菌の定常増殖期に自己消化を引き起こします。 教育 J. 18、4108–4117。

記事 CAS Google Scholar

Mengin-Lecreulx, D.、Michaud, C.、Richaud, C.、Blanot, D. & van Heijenoort, J. dapF によってコードされるジアミノピメリン酸エピメラーゼを欠く大腸菌変異体のペプチドグリカンへの 11-ジアミノピメリン酸の組み込み。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 170、2031–2039 (1988)。

記事 CAS Google Scholar

Catherwood, AC et al. 大腸菌 PBP1B によるペプチド転移によるペプチドグリカン架橋の基質および立体化学的制御。 混雑する。 化学。 社会 142、5034–5048 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Whitfield, C. 大腸菌における莢膜多糖の生合成と集合。 アンヌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． 75、39–68 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

Rai、AK および Mitchell、AM 腸内細菌の共通抗原: 謎の分子の合成と機能。 MBio 11、1–19 (2020)。

記事 Google Scholar

Bertani, B. & Ruiz, N. リポ多糖の機能と生合成。 EcoSal Plus https://doi.org/10.1128/ecosalplus.ESP-0001-2018 (2018)。

Bahadur, R.、Chodisetti, PK & Reddy, M. 1,d-トランスペプチダーゼのパラログ、LdtF による細菌ペプチドグリカンからのブラウン リポタンパク質 Lpp の切断。 手順国立アカド。 科学。 USA 118、e2101989118 (2021)。

ウィンクル、M.ら。 Dpaa はブラウンのリポタンパク質をペプチドグリカンから切り離します。 MBio 12、e00836-21 (2021)。

ドワイヤー、DJ 他抗生物質は、致死性の一部として酸化還元に関連した生理学的変化を引き起こします。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 111、E2100–E2109 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Atze、H. et al. 重同位体標識と質量分析により、薬剤に反応した細菌細胞壁の拡大の予期せぬ再構築が明らかになります。 Elife 11、e72863 (2022)。

ロハス、ER 他。 外膜はグラム陰性菌にとって必須の耐荷重要素です。 ネイチャー 559、617–621 (2018)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Mathelié-Guinlet, M.、Asmar, AT、Collet, JF & Dufrêne, YF リポタンパク質 Lpp は、大腸菌細胞エンベロープの機械的特性を調節します。 ナット。 共通。 11、1–11 (2020)。

記事 Google Scholar

May, KL & Grabowicz, M. 細菌の外膜は進化する抗生物質バリアです。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 115、8852–8854 (2018)。

記事 ADS CAS Google Scholar

モナハン、LG 他緑膿菌の球状細胞形態型への急速な変換は、カルバペネムおよびペニシリンに対する耐性を促進しますが、抗菌ペプチドに対する感受性を高めます。 抗菌。 エージェント・ケマザー。 58、1956 ～ 1962 年 (2014)。

記事 Google Scholar

マーサ、AN et al. 高レベルのカルバペネム耐性には、抗生物質による外膜の修飾が必要です。 PLoS 病巣。 18、e1010307 (2022)。

Yao, Z.、Kahne, D. & Kishony, R. ベータラクタム系抗生物質下での独特の単一細胞の形態学的ダイナミクス。 モル。 セル 48、705–712 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

クロス、T. et al. グラム陰性病原体におけるスフェロプラスト媒介カルバペネム耐性。 抗菌。 エージェント・ケマザー。 63、e00756-19 (2019)。

Datsenko, KA & Wanner, BL PCR産物を使用した大腸菌K-12の染色体遺伝子のワンステップ不活化。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 97、6640–6645 (2000)。

記事 ADS CAS Google Scholar

馬場 哲 他大腸菌 K-12 インフレーム単一遺伝子ノックアウト変異体の構築：慶応コレクション。 モル。 システム。 バイオル。 2、2006.0008 (2006)。

DeJesus, MA、Ambadipudi, C.、Baker, R.、Sassetti, C. & Ioerger, TR TRANSIT - Himar1 TnSeq 解析用のソフトウェア ツール。 PLoS コンピューティング。 バイオル。 11、e1004401 (2015)。

記事 ADS Google Scholar

Li, H. & Durbin, R. Burrows-Wheeler 変換による高速かつ正確なロングリード アライメント。 バイオインフォマティクス 26、589–595 (2010)。

記事 Google Scholar

Jiang, Y. et al. CRISPR-Cas9 システムを介した大腸菌ゲノムの多重遺伝子編集。 応用環境。 微生物。 81、2506–2514 (2015)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Langella, O. & Rusconi, F.mineXpert2: MS n 質量分析データの全深度の可視化と探索。 混雑する。 社会質量スペクトル。 32、1138–1141 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Paradis-Bleau, C.、Kritikos, G.、Orlova, K.、Typas, A. & Bernhardt, TG 細菌エンベロープ生合成変異体のゲノムワイドなスクリーニングにより、細胞壁前駆体の代謝に関与する新規因子が同定されました。 PLoS ジュネット。 10、e1004056 (2014)。

記事 Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この研究は、フランス国立研究機関 ANR 'RegOPeps' (JEH への助成金 ANR-19-CE44-0007) によって支援されました。 HV はソルボンヌ大学から博士フェローシップ (ED 515、Complexité du Vivant) を受賞しています。 トランスポゾン挿入シーケンスについては、ProfileXpert/Viroscan3D ゲノム プラットフォームの J. Lachuer と J. Bertrand に感謝します。 国立自然史博物館の高原分光法分析装置における質量スペクトルの収集における技術的支援については、A. Marie に感謝します。 抗 Lpp 抗体と抗 RpoA 抗体の寛大な寄贈に対して、JF Collet と C. Beloin にそれぞれ感謝します。 原稿を批判的に読んでくださった Z. エドオと F. ルスコーニに感謝します。

ミッシェル・アーサー、ジャン＝エマニュエル・ユゴネなどの著者も同様に貢献しました。

ソルボンヌ大学コルドリエ研究センター、パリ・シテ大学インセルム、F-75006、パリ、フランス

アンリ・ヴォエディ、グエンナディ・セゾノフ、ミシェル・アーサー、ジャン＝エマニュエル・ユゴネ

パスツール研究所、パリ シテ大学、計算生物学部、F-75015、パリ、フランス

ショーン・P・ケネディ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

HV: 構想と設計、データの取得、分析、解釈、記事の草稿と修正。 SK: データの分析、記事の草稿と修正。 GS: 記事の草稿と修正。 MA と JEH: 構想と設計、データの分析と解釈、記事の草案と改訂。

ミッシェル・アルチュールまたはジャン＝エマニュエル・ユゴネとの往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた他の匿名の査読者に感謝します。 査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Voedts、H.、Kennedy、SP、Sezonov、G. 他。 大腸菌における代替ペプチドグリカン架橋に必要な遺伝子をゲノムワイドに同定したところ、β-ラクタムの予期せぬ影響が明らかになった。 Nat Commun 13、7962 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-35528-3

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 8 月 11 日

受理日: 2022 年 12 月 6 日

公開日: 2022 年 12 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35528-3

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。