SMC5/6複合体によるエピジェネティックなサイレンシングはHIVを媒介する

Sep 15, 2023

Nature Microbiology volume 7、pages 2101–2113 (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

ウイルスの侵入と逆転写の後、組み込みに失敗した HIV-1 プロウイルスはエピジェネティックにサイレント化されますが、その根底にあるメカニズムは不明のままです。 ゲノムワイドな CRISPR/Cas9 ノックアウト スクリーニングを使用して、宿主 SMC5/6 複合体がこのエピジェネティック サイレンシングに必須であることを特定しました。 我々は、SMC5/6が統合されていないクロマチン化HIV-1 DNAに結合し、SUMO化することを示す。 SMC5/6 コンポーネント NSMCE2 (SUMO E3 リガーゼ) の点突然変異誘発、または SUMO 化阻害剤 TAK-981 の使用による SUMO 化の阻害は、エピジェネティックなサイレンシングを防ぎ、統合されていない HIV-1 DNA からの転写を可能にし、インテグラーゼ欠損タンパク質の複製をレスキューします。 HIV-1。 最後に、SMC5/6 複合体の発現をブロックすること、またはその SUMO 化活性を阻害すると、CD4+ T 細胞株と初代ヒト T 細胞の両方における潜伏性 HIV-1 感染の確立が抑制されることを示します。 まとめると、我々のデータは、SMC5/6複合体が、組み込み能のあるHIV-1プロウイルスを組み込み前にエピジェネティックにサイレンシングすることにより、HIV-1潜伏期間の確立を媒介することに直接的な役割を果たしているということを示している。

プロウイルス DNA の宿主細胞ゲノムへの組み込みは、プロウイルスの転写と複製に不可欠なレトロウイルスのライフサイクルの決定的な特徴です 1,2。 インテグラーゼ (IN) 阻害剤は、HIV-1 の複製を強力に阻害します3。 機能的 IN が存在しない場合、統合されていない HIV-1 プロウイルスは、ヒストン H3 上のリジン 9 のトリメチル化 (H3K9me3) などの抑制的なエピジェネティック マークを蓄積し、H3 アセチル化 (H3Ac) などの活性化マークが枯渇します 4,5。 組み込まれていない HIV-1 DNA からの転写のエピジェネティックなサイレンシングはおそらく外来 DNA に対する宿主防御を表しているが、この効果を媒介する根底にあるメカニズムと細胞因子は依然として不完全に定義されている6、7。

マウス白血病ウイルス (MLV) では、ゲノムスクリーニングにより、ヒトサイレンシングハブ (HUSH) 複合体の構成要素と、統合されていない MLV DNA サイレンシングに重要な DNA 結合タンパク質 NP220 が同定されました 8。 しかし、その後の研究 9,10 では、組み込まれていない HIV-1 のサイレンシングにおける HUSH 複合体または NP220 の役割は検出できませんでした。 最近では、HIV-1 Vpr タンパク質によって下方制御されていることが判明した 1,217 個のヒト遺伝子のスクリーニングにより、染色体 (SMC) 5/6 複合体の構造維持の構成要素である SMC5/6 複合体局在化因子 2 (SLF2) が重要であることが特定されました。統合されていない HIV-1 DNA サイレンシング用。 このスクリーニングでは、SMC5 および 6 を含む SMC5/6 複合体の他の 6 つの構成要素と 4 つの SMC5/6 関連タンパク質が染色体要素 1 ～ 4 (NSMCE1 ～ 4) の非構造維持に関与しているが、SMC5/6 複合体は維持されていないことも示されました。 6 つの関連因子 SLF1 も、組み込まれていない HIV-1 DNA のエピジェネティックなサイレンシングに重要でした9。 注目すべきことに、SMC5/6複合体はB型肝炎ウイルス（HBV）非構造タンパク質HBXによって分解されることが以前に示されており、HBXの非存在下ではエピソームHBV DNAもエピジェネティックにサイレンシングされる11,12。 したがって、SMC5/6 複合体は染色体の複製、組換え、修復に関与するだけでなく 13 、侵入するウイルス DNA を沈黙させることもできます。 ここで我々は、SMC5/6複合体が潜伏性HIV-1感染の確立を媒介するかどうかを判定しようとした。

統合されていない HIV-1 DNA を転写的にサイレンシングする因子を同定するために、ヒト CD4+ T 細胞株 CEM-SS でゲノムワイドな CRISPR/Cas9 ノックアウト スクリーニング 14 を実施しました。 われわれは、化膿連鎖球菌 Cas9 を発現する CEM-SS サブクローンに、19,114 個のヒト遺伝子を標的とする約 80,000 個のシングルガイド RNA (sgRNA) を発現するレンチウイルス ライブラリーを形質導入しました15。 7日後、これらの細胞にIN- NL-GFPΔEnv10、envの欠失、INの不活化D64V変異16、およびnefの代わりの緑色蛍光タンパク質（GFP）オープンリーディングフレームを有するHIV-1誘導体を感染させた。 このウイルスは、vpr を含む他の 6 つの HIV-1 遺伝子の完全なコピーを保持しています。 感染後 48 時間 (hpi) で、GFP+ 細胞を蛍光活性化セルソーティング (FACS) によって収集し、(ポリメラーゼ連鎖反応) PCR によって sgRNA を回収し、同じレンチウイルス ベクターにクローニングしました。 GFP+ 細胞の 3 ラウンドの選択後、sgRNA の配列を決定し、開始時の sgRNA ライブラリーと比較して濃縮するために分析しました。 図1aの火山プロットに示すように、16倍を超えて濃縮され、P値<0.0005を有する9つの遺伝子を同定しました。 これらには、3 つの細胞表面受容体 (LY9、OR52N2、および SSTR2) と 1 つのモータータンパク質 (MYO1B) が含まれていましたが、これらはさらに分析されていませんでした。 この分析により、SMC5/6複合体の8つの既知の構成要素のうちの4つ、すなわちSMC5、SMC6、SLF1、およびNSMCE3、およびDNA修復タンパク質SWI5も回収されました（図1a）。

a、各遺伝子に特異的な sgRNA の平均倍率変化とその誤検出率 (FDR) 補正された P 値のボルケーノ プロット。 倍率変化が 16 を超え、P 値が 0.0005 未満の遺伝子 (赤い線で囲まれた部分) がラベル付けされます。 簡単に説明すると、ネガティブ二項 (NB) モデルを使用して個々の sgRNA の P 値を計算し、次にソートされた sgRNA P 値を使用して、MAGeCK-VISPR のロバストランク集計 (αRRA) アルゴリズムを使用して個々の遺伝子の FDR 補正された P 値を計算しました。 。 SMC5/6 複合体のメンバーは緑色です (FDR 補正された P 値: SMC5 = 7.8 × 10−7、SMC6 = 0.00033、NSMCE3 = 0.00010、SLF1 = 0.00017)。 b、MOI約0.3のIN-NL-GFPΔEnvレポーターウイルスを用いた2dpiでのWT CEM-SS細胞および示されたクローンノックアウト細胞株のフローサイトメトリー。 3 つの生物学的複製からの代表的な実験を示します。 c、d、MOI約0.3のIN + NL-GFPΔEnvレポーターウイルスを使用した2 dpiのWT（c）またはΔSMC5 CEM-SS（d）細胞のフローサイトメトリー。 3 つの生物学的複製からの代表的な実験が示されています。 e-h、親CEM-SS Cas9細胞、またはΔSMC5およびΔSLF2 CEM-SSクローンのIN+またはIN- NL-NLucによる感染の時間経過。 e、生細胞。 f、ウイルス的にコード化されたNLuc発現。 g、全 HIV-1 DNA。 h、示された dpi で定量化された総 HIV-1 RNA 発現。 すべての IN+ HIV-1 感染培養物は、7 dpi までにウイルスの細胞変性により死滅しました。 DNA および RNA レベルを qPCR によって定量化し、1 dpi で IN+ HIV-1 感染 CEM-SS Cas9 細胞に対して正規化し、1 に設定しました。3 つの生物学的複製の平均 ± sd。

ソースデータ

これら 5 つのタンパク質と他の 4 つの既知の SMC5/6 複合体構成要素 (NSMCE1、2、4、および SLF2) の重要性を確認するために、2 つの独立した sgRNA を使用して CEM-SS Cas9 細胞におけるそれらの発現を阻害しました (拡張データ図) . 1）。 8 つの SMC5/6 コンポーネントのいずれかをノックダウンすると、IN-NL-GFPΔEnv ベクターからの GFP 発現が大幅に強化されました。 SWI5 のノックダウンは効果がなかったため、この遺伝子は偽陽性であると考えられました。

次に、CEM-SS細胞でSMC5、SMC6、NSMCE2、NSMCE4、SLF1、およびSLF2のクローンノックアウト細胞株を生成しました。 NSMCE2 を除く各場合において、クローン変異の可能性を避けるために 2 つの独立したノックアウト細胞株を生成しました。 これらの遺伝子ノックアウトは、DNA配列決定（補足表1）およびウェスタンブロット（拡張データ図2）によって不活化フレームシフト変異を同定することによって検証されました。 変異細胞は、野生型 (WT) CEM-SS 細胞と同じ増殖速度を示しました (拡張データ図 3)。 GFP をナノルシフェラーゼ (NLuc)10 に置き換えた IN-NL-NLucΔEnv レポーターを使用したこれらの細胞株の感染により、組み込まれていない HIV-1 DNA からの NLuc 発現の部分的なレスキューが明らかになりました (拡張データ図 3d)。 さらに、これらのノックアウトクローンをIN- NL-GFPΔEnvウイルスに約0.3の感染多重度（MOI）で感染させると、WTで見られるのと同様のレベルのGFP +細胞（29％から43％陽性、図1b）が明らかになりました。 CEM-SS細胞はIN+型のNL-GFPΔEnvに感染しました（32％陽性、図1c）が、IN+ウイルスはより高い平均蛍光強度を誘導しました。 ΔSMC5 CEM-SS細胞をIN+型のNL-GFPΔEnvで感染させると、WT CEM-SS細胞と比較してより多くのGFP+細胞が得られた(図1c対1d)。 HIV-1 プロウイルスの組み込みは非効率的であるため 17、我々は、この増加は組み込まれていない IN+ HIV-1 DNA の転写によるものであると仮説を立てています。 IN- NL-GFPΔEnv ウイルスによる WT CEM-SS 細胞の感染では、GFP+ 細胞は生成されませんでした (図 1b)。

私たちは、SMC5/6複合体機能を欠く細胞がIN-HIV-1の複製をサポートするかどうか疑問に思いました。 図1e〜hに示すように、不活化D64Vインテグラーゼ変異を持つIN-HIV-1は実際にΔSMC5およびΔSLF2サブクローンで感染拡大を確立し、感染後14日（dpi）までにかなりのレベルのウイルスDNA、RNA、およびタンパク質発現を達成しました。ラルテグラビルの存在下で増殖させた場合、復帰突然変異を防ぐことができます。 WT CEM-SS 細胞では IN-HIV-1 の複製は観察されませんでした（図 1f-h）。 機能的なSMC5/6複合体を欠く細胞におけるIN-HIV-1複製は、16dpiまでに培養物全体を死滅させるウイルス細胞変性を引き起こした（図1e）。 重要なのは、14 dpi では、不活性化する D64V IN 変異が完全に保持されていることです。 さらに、組み込まれていない HIV-1 DNA に特徴的な 2 つの長いターミナル リピート (2LTR) サークルが IN+ ウイルスと IN- ウイルスの両方に感染した培養液で検出されましたが、組み込まれた HIV-1 は、Alu-1 によるゲノム内の Alu リピート領域への組み込みを定量することによって検出されました。ベースの定量的 PCR (Alu-qPCR)18 は前者にのみ存在しました (拡張データ図 3b、c)。 したがって、SMC5/6複合体を欠く細胞におけるIN- HIV-1の複製は確かにIN+ HIV-1よりも遅いですが（図1f〜h）、IN- HIV-1がまったく複製できることは注目に値します。

組み込まれていない HIV-1 DNA のエピジェネティックな抑制は、抑制性ヒストン修飾 H3K9me3 の追加と活性化修飾 H3Ac および H3K4me34,10 の喪失と相関しています。 したがって、SMC5/6複合体の喪失がエピジェネティックなサイレンシングを妨げるかどうかをテストしました。 統合されていないIN- HIV-1 DNAへの活性化H3AcおよびH3K4me3修飾の追加の分析により、ΔSMC5およびΔSLF2サブクローンにおけるIN+ HIV-1で見られるのと同様のレベルが明らかになりました（拡張データ図4a、b）。 同様に、SMC5/6複合体を欠く細胞は、組み込まれていないHIV-1 DNA上の阻害性H3K9me3修飾の喪失を示しました（拡張データ図4c）。 対照的に、ウイルスDNAに結合する総ヒストンH3のレベル（拡張データ図4d）もH3K27me3のレベル（拡張データ図4e）も、それほど影響を受けませんでした。

HIV-1 Vpr タンパク質は、組み込まれていない HIV-1 DNA からの遺伝子発現を増強し 9,19、SMC5/6 コンポーネント SLF29 を分解することが報告されていますが、我々は以前、Vpr の過剰発現が IN-HIV-110 からの遺伝子発現を増強しないことを報告しました。 WT Vpr+ ウイルスはインテグラーゼ阻害剤によって強力に阻害されます3。 組み込まれていないウイルス遺伝子発現に対するVprの効果を試験するために、WTまたはΔSMC5 CEM-SS細胞にIN-NL-GFPΔEnvウイルス±Vprを感染させましたが、識別可能な違いは見られませんでした（拡張データ図5）。

SMC5/6 複合体は、SUMO E3 リガーゼ NSMCE220,21 を介して、それ自体 13 を含むいくつかのタンパク質基質を SUMO 化します。 DNA 結合によって刺激される SUMO 化活性 22 は、DNA 修復と組換えにおける SMC5/6 複合体の役割に不可欠です 13。 ヒストン H4 を含むいくつかのクロマチン成分は SUMO 化される可能性があり、ヒストンの SUMO 化は転写抑制に関連しています 23,24。 SMC5/6によるクロマチンSUMO化が未統合HIV-1 DNAのエピジェネティックサイレンシングに寄与しているかどうかを判断するために、DNA配列決定（補足表1）およびウェスタンブロッティング（拡張データ図2）によって確認されたように、CEM-SS細胞のNSMCE2をノックアウトしました。 。 NSMCE2 の喪失により、IN- NL-GFPΔEnv ウイルスからの GFP 発現が回復しました。 このレスキューは、WT NSMCE2の異所性発現ではブロックされましたが、必須のRINGフィンガードメインに導入されたC185S / H187Q変異によりSUMO化活性を欠くNSMCE2ΔSUMO変異体ではブロックされませんでした25（図2a）。 同様の結果が、IN- NL-NLucΔEnv レポーター ウイルスでも観察され、ΔNSMCE2 サブクローンにおける NSMCE2 発現の喪失が、組み込まれていない HIV-1 DNA からの NLuc 発現をレスキューし、このレスキューは WT の発現によってブロックされたが、変異体 NSMCE2 の発現によってブロックされなかったという点で観察されました（図 2b）。 ）。 これは、NSMCE2ΔSUMO変異体の不安定性によるものではありませんでした（図2c）。 さらに、WT型とΔSUMO型のNSMCE2は両方とも、統合されていないHIV-1 DNAに結合し、NSMCE2発現の喪失は、SMC5 / 6複合体のSMC5成分のウイルスDNAへの動員を阻害しませんでした（図2d）。 IN- NL-GFP に感染した WT CEM-SS、ΔNSMCE2、および ΔSMC5 細胞における SUMO2/3 に特異的な抗体を使用したクロマチン免疫沈降 (ChIP) – qPCR では、WT 細胞では組み込まれていないクロマチン化 HIV-1 DNA 上の SUMO 修飾が容易に検出されましたが、WT 細胞では検出されませんでした。 NSMCE2またはSMC5のいずれかを欠く細胞は、バックグラウンドレベルの抗体結合を示しました（図2d、e）。

a、何も発現しないレンチウイルスベクター、FLAG-NSMCE2またはFLAG-NSMCE2ΔSUMO変異体を形質導入し、その後MOI ~ でIN- NL-GFPΔEnvを感染させたWTまたはΔNSMCE CEM-SS T細胞の2 dpiでのフローサイトメトリー0.3。 3 つの生物学的複製からの代表的な実験を示します。 b、IN+またはIN-NL-NLucΔEnvに感染した示された細胞におけるウイルスにコードされたNLuc発現の定量。 NLuc 発現は、WT CEM-SS 細胞の IN- HIV-1 感染に対して正規化され、1 に設定されました (**P = 0.0010、***P = 0.0009、****P < 0.0001、一元配置分析)分散 (ANOVA)、ダネット検定)。 c、示された細胞型の形質導入後のFLAGタグ付きWT FLAG-NSMCEおよびNSMCE2ΔSUMO発現の代表的なウェスタンブロット。 d、WTまたはΔNSMCE CEM-SS T細胞の未統合IN-HIV-1 DNAに結合し、異所的に発現したFLAGタグ付きNSMCE2または内因性SMC5のレベルのChIP-qPCR定量化。 SUMO2/3 沈着は ChIP-qPCR によっても測定されました（ΔNSMCE2 + NSMCE2 ***P = 0.0002、ΔNSMCE2 + NSMCE2ΔSUMO ***P = 0.0003; 2 元配置分散分析、ダネット検定）。 e、IN-NL-GFPΔEnvに感染したWT細胞およびΔSMC5 CEM-SS細胞における2dpiでのHIV-1 LTR上のSUMO2/3沈着レベルの定量化。 IgG は陰性対照として機能しました (****P < 0.0001、二元配置分散分析、シダック検定)。 b、d、およびeのデータは、3つの生物学的複製の平均値±標準偏差です。

ソースデータ

クロマチンの SUMO 化が、組み込まれていない HIV-1 DNA のエピジェネティックなサイレンシングに重要である場合、SUMO 化を阻害する薬剤は、IN- HIV-1 による遺伝子発現を救出する必要があります。 抗がん剤 TAK-981 は、タンパク質の SUMO 化の最初のステップを触媒する SUMO 活性化酵素の特異的阻害剤です26。 IN-NL-NLucΔEnvレポーターによる感染後のWT CEM-SS細胞およびΔSMC5サブクローンにおいてTAK-981用量反応実験を実施しました。 5 nM ～ 1,000 nM のレベルの TAK-981 を 0 dpi で添加し、細胞を溶解し、2 dpi で NLuc レベルを定量しました。 TAK-981は確かに、統合されていないHIV-1 DNAからのNLuc発現をブーストし、WT細胞におけるIN-NL-NLucΔEnvベクターからのNLuc発現レベルがΔSMC5細胞で誘導されるレベルと等しくなる約75nMでプラトーに達しました（図3a）。 。 対照的に、TAK-981は、試験したすべての用量でΔSMC5細胞におけるIN-NL-NLucΔEnvレポーターからの遺伝子発現に影響を及ぼさず、WT CEMにおける未組み込まれたHIV-1 DNAからの遺伝子発現に対するTAK-981のプラスの効果が主張される。 SS 細胞は完全に SMC5/6 機能の阻害によるものでした。

a、IN- NL-NLucΔEnv に感染させ、0 日目から指定濃度の TAK-981 で処理した WT およびΔSMC5 CEM-SS 細胞における 2 dpi でのウイルス NLuc 発現 (****P < 0.0001、*P = 0.015) ; 2元配置分散分析、シダック検定)。 b、IN+ または IN- HIV-1 ±150 nM の TAK-981 に感染した CEM-SS 細胞における非スプライス (Gag mRNA)、単一スプライス (A1D1) および多重スプライス (A4D7) RNA のウイルス RNA レベル、2 dpi で測定。 RNA レベルは、TAK-981 を使用しない WT HIV-1 感染を 1 に設定して正規化し、両側対応のないウェルチ t 検定を使用して統計を計算しました (Gag: *P = 0.037、***P = 0.004; A1D1: *P = 0.033、**P = 0.0012、A4D7: **P = 0.0059、**P = 0.0078)。 c、IN- NL-NLucΔEnvに感染させ、示されたhpiで150 nM TAK-981を添加したWTおよびΔSMC5 CEM-SS細胞における3 dpiでのウイルスNLuc発現。 NLuc 発現は、TAK-981 で処理されていない WT CEM-SS 細胞と比較して与えられ、1 に設定されます。 d – f、ChIP – qPCR により SUMO2/3 (d)、H3Ac (e)、および H3K9me3 ( f) 3 dpi で HIV-1 LTR に堆積。 TAK-981 (150 nM) を指定の hpi で添加しました。 d〜fのデータは、二元配置分散分析、テューキー検定を使用して分析されました（****P < 0.0001、**P = 0.0012）。 a〜fのデータは、3回の生物学的複製の平均値±標準偏差です。

ソースデータ

HIV-1 mRNA 発現に対する TAK-981 の影響に対処するために、我々は qPCR を使用して、WT または IN- HIV-1 に感染した WT CEM-SS T 細胞におけるスプライスされていない、単一スプライスされた、および完全にスプライスされた HIV-1 転写物のレベルを定量しました。 150 nM TAK-981 の存在下または非存在下で (図 3b)。 TAK-981 は、IN+ HIV-1 によるウイルス RNA 種の発現を適度に、しかし有意に増加させ、IN- HIV-1 からのウイルス RNA の 3 つのクラスすべての発現を強力に促進しました。

TAK-981 の添加時間が、組み込まれていない HIV-1 DNA からのウイルス遺伝子発現に差次的に影響を与えるかどうかを判断するために、WT または ΔSMC5 CEM-SS 細胞に IN- NL-NLuc ΔEnv を感染させ、その後、異なる時点で TAK-981 を添加しました。 0 ～ 48 hpi (図 3c)。 72 hpi で細胞を溶解し、NLuc 活性を測定しました。 ０ｈｐｉでのＴＡＫ－９８１の添加は、ＩＮ－ＮＬ－ＮＬｕｃΔＥｎｖレポーターウイルスからのＮＬｕｃ発現をΔＳＭＣ５サブクローンで見られるレベルまで回復させ、これは２４ｈｐｉまで真実のままであった。 しかし、TAK-981によるNLuc発現の回復は36 hpiまでに弱くなり、48 hpiでは検出できなくなりました。 TAK-981 の添加が実際に、組み込まれていないクロマチン化 HIV-1 DNA の SUMO 化を阻害したかどうかを検討するために、ChIP-PCR を実行して、150 nM の存在下および非存在下で、WT CEM-SS 細胞のウイルス LTR に存在する SUMO レベルを決定しました。 TAK-981、およびΔSMC5 クローンでは、3 dpi、IN- NL-NLucΔEnv で。 TAK-981の添加により、薬剤が感染後の早期に添加されたか後期に添加されたかに関係なく、組み込まれていないHIV-1 DNAからSUMOが消失しました（図3d）。 したがって、TAK-981は、36 hpi以降に添加した場合、組み込まれていないHIV-1 DNAからの遺伝子発現を回復することには効果がありませんが（図3c）、ウイルスDNA上の動的なSUMO修飾の維持を防ぐことには引き続き効果があります（図3c）。 3d）。 これらのデータは、SMC5/6 による SUMO 化が、組み込まれていない HIV-1 DNA のエピジェネティックなサイレンシングを引き起こすが、サイレント状態を維持するためには必要ではないことを示唆しています。 この仮説は、TAK-981の存在下および非存在下で未統合ウイルスDNAに存在するエピジェネティック修飾のChIP-qPCR分析によってさらに裏付けられました（図3e、f）。 16 hpi または 24 hpi で 150 nM TAK-981 を添加すると、組み込まれていないクロマチン化 HIV-1 DNA への活性化 H3Ac エピジェネティック修飾の付加がレスキューされ、抑制性 H3K9me3 マーカーの付加がブロックされました。 対照的に、TAK-981 は 36 hpi までに、組み込まれていない HIV-1 DNA のエピジェネティックなサイレンシングを逆転させる効果がなくなりました。 したがって、TAK-981 は、感染後早期に適用すれば IN- HIV-1 のエピジェネティックな抑制を防ぐことができますが、既存のエピジェネティックに沈黙化された IN- HIV-1 プロウイルスを救済することはできないため、潜伏期間を逆転させる薬剤 (LRA) としては機能しません。 ）。

最近、IN+ HIV-1 の感染により、組み込み前にエピジェネティックに沈黙し、組み込み後も沈黙したままのプロウイルスが生成され、潜在的に感染した T 細胞が生成される可能性があることが提案されました 27。 もし正しければ、SMC5/6 による未統合 HIV-1 DNA のサイレンシングを阻害すると、潜在的に感染した T 細胞の形成も阻害されるはずです。 この仮説を検証するために、SMC5/6 発現の喪失または 0 dpi での TAK-981 による処理が CEM-SS T 細胞における潜在的な HIV-1 感染の確立を阻害するかどうかを調べました。 使用されるアッセイ 28 には、TAK-981 の存在下または非存在下で、MOI ～ 0.1 での WT または ΔSMC5 CEM-SS 細胞の IN+ NL-GFPΔEnv インジケーター ウイルスの感染が含まれます。 3 dpi で細胞を FACS に供し、未感染細胞または潜在的に HIV-1 感染細胞を表す GFP 陰性細胞を単離しました。 FACSプロファイルは、0 dpiでTAK-981で処理したWT CEM-SSおよびTAK-981処理に関係なくΔSMC5 CEM-SSにおいて、より高いレベルのGFP + 細胞を再び示しました（拡張データ図6a）。これはおそらく再び以下の結果であると考えられます。統合されていない IN+ HIV-1 プロウイルスの転写。 単離された GFP 陰性細胞をさらに 6 日間培養し、希釈剤ジメチルスルホキシド (DMSO) または TAK-981、ホルボールミリスチン酸酢酸 (PMA)、または腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α) で処理しました。 PMA と TNF-α は両方とも、NF-κB 活性と効果的な LRA の強力な活性化因子です 28,29。 1日後、10 dpiで細胞を再びFACSによって分析した(代表的な実験を図4aに示し、3つの独立した生物学的複製の編集を図4bに示す)。 重要なことに、統合されていないすべての HIV-1 DNA は感染 CEM-SS 細胞から 7 dpi までに失われているため (拡張データ図 6b)、10 dpi で見られる GFP 発現は統合されたプロウイルスに由来するものでなければなりません。

WT または ΔSMC5 CEM-SS 細胞を IN+ NL-GFPΔEnv ±TAK-981 に感染させました。 3 dpi で、GFP - 細胞を FACS によって単離し (関連する FACS プロファイルについては拡張データ図 6a を参照)、細胞をさらに 6 日間培養して、組み込まれていない HIV-1 DNA をすべて消失させました (拡張データ 図 6a)。 6b) 希釈剤ジメチルスルホキシド (DMSO)、TAK-981、または LRA PMA または TNF-α のいずれかで処理する前。 1 日後、10 dpi で緑色蛍光タンパク質 (GFP) の発現を FACS によって分析しました。 a、代表的なFACSプロファイル。 b、3つの生物学的複製の平均±sdを示すaのデータの要約(****P < 0.0001、二元配置分散分析、テューキー検定)。 c、薬物添加前に、示された細胞内の総 HIV-1 DNA を 9 dpi で定量しました。 データは、3 つの生物学的複製の平均 ± SD です (****P < 0.0001、一元配置分散分析、ダネット検定)。

ソースデータ

WT CEM-SS細胞では、PMAとTNF-αの両方が、選別されたGFP陰性細胞の約5％でGFP発現を誘導しましたが、誘導されていない培養物中のGFP +細胞のレベルは約0.3％でした（図4a、b）。非常に有意な差 (P < 0.001)。 対照的に、9 dpi での PMA または TNF-α 処理は、0 dpi で TAK-981 で処理した WT CEM-SS 細胞、または TAK の非存在下または存在下での ΔSMC5 CEM-SS クローンでは、バックグラウンドを超える GFP 発現を誘導できませんでした。 0 dpiでの-981処理（図4a、b）、GFP発現によって測定されるこれらの細胞の初期感染は、実際にはWT CEM-SS細胞で見られるよりも高かった（拡張データ図6a）。

SMC5/6 複合体機能の喪失が実際に潜伏性 HIV-1 感染の確立を阻害する場合、FACS で分類された WT GFP- 細胞 (拡張データ図 6) には、GFP- 細胞よりも多くの潜伏性 HIV-1 プロウイルス DNA が含まれるはずです。感染時にはSMC5/6の機能が欠如していた。 実際、薬物添加前に9 dpiで行われたqPCR分析により、単離されたWT GFP-細胞には、当時のGFP- ΔSMC5細胞またはTAK-981で処理されたWT細胞よりも有意に（P < 0.001）多くのHIV-1 DNAが実際に含まれていることが実証されました。感染の様子（図4c）。

組み込まれていない HIV-1 DNA のエピジェネティックなサイレンシングが潜伏感染の確立につながる可能性がある場合、組み込みの遅延により潜伏感染の数が増加する可能性があります。 このアイデアをテストするために、インテグラーゼ阻害剤ラルテグラビルの存在下または非存在下で、WT CEM-SS 細胞に IN+ 型の NL-GFPΔEnv インジケーター ウイルスを感染させました。 薬物は2 dpiで洗い流され、GFP-細胞は5 dpiでFACSによって単離された。 次いで、細胞を希釈剤、PMAまたはTNF-αで11 dpiで処理し、FACSによって12 dpiで分析した。 0～2 dpiでのラルテグラビルによる処理は、5 dpiで検出されたGFP+、つまり増殖性感染の数が同様であったにもかかわらず、PMAまたはTNF-αでの処理後にGFPを発現する細胞の割合を実際に増加させた(拡張データ図1)。 7）。 したがって、プロウイルス DNA 合成と組み込みの間の時間を大幅に延長すると (P < 0.001)、LRA によって活性化される潜在的に組み込まれたプロウイルスの数が増加します。 これらのデータは、HIV-1 の潜伏期間が実際にプロウイルス統合前に確立できることを示しています。

SMC5 / 6が初代細胞におけるウイルス潜伏期間の確立にも寄与しているかどうかを調べるために、我々はまず、TAK-981が感染した初代CD4 + T細胞において統合されていないHIV-1 DNAからの遺伝子発現もレスキューできることを確認しました（図5a）。 次に、二色レポーターウイルスを使用する HIV-1 潜伏期間のアッセイを使用して、TAK-981 が初代 CD4+ T 細胞における潜伏性 HIV-1 感染の確立を阻害できるかどうかを調べました 30,31。 これらのウイルスでは、GFP は潜伏感染では抑制される HIV-1 LTR の制御下で発現しますが、mCherry はエピジェネティックな抑制に耐性のある外因性 EF1-α プロモーターを使用して発現します。 デュアルカラー HIV-1 レポーターによる T 細胞の感染により、増殖性感染を表す GFP+ および mCherry+ の細胞と、潜伏性感染を表す GFP- であるが mCherry+ である細胞が生成されます。 したがって、我々は、IN+ デュアルカラーレポーターウイルスに感染した細胞に TAK-981 を 6 dpi ではなく 0 dpi で添加すると、すべてが統合されていない最も早い時点である 7 dpi での GFP- mCherry+ 細胞のレベルに影響を与えるかどうかを調べました。 HIV-1 DNA は失われているでしょう (拡張データ図 8a)。

ａ、血液から単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を、０ｈｐｉで、ＤＭＳＯ中の１５０ｎＭ ＴＡＫ－９８１の存在下、またはＤＭＳＯのみで、ＩＮ＋またはＩＮ－ＮＬ－ＮＬｕｃΔＥｎｖに感染させた。 細胞を48 hpiで収集し、溶解し、NLucレベルを測定した。 3 回の生物学的反復の平均 ± SD (**P = 0.0045、対応のない両側 t 検定)。 b、CD4+ T細胞を、感染時に添加したDMSOまたは150 nM TAK-981の存在下、または150 nM TAK-981を使用して、〜0.05の低MOIで複製欠損GFP/mCherryデュアルカラーレポーターウイルスに感染させました。または 80 nM PMA を 6 dpi で添加します。 次に、GFP および mCherry 発現細胞の数を FACS によって 7 dpi で測定しました。 c〜e、bと同様に実行された5つの独立した一次CD4+ T細胞感染からのデータ。 TAK-981 が存在しない場合は 0 dpi で追加されます。 同じ T 細胞サンプル ±TAK-981 を使用した個々の実験は線でリンクされています。 f、両側比対応のあるt検定を使用した、c〜eに示されたデータからの比率の統計分析。

ソースデータ

実際、TAK-981 を 0 dpi で添加した場合、潜在的に感染している GFP- mCherry+ 初代 T 細胞の数の一貫した減少が観察されました (図 5b では 2.11% から 0.79%)。予測どおり、TAK-981を6 dpiで添加したときのGFP- mCherry+ 細胞のレベル（図5b、拡張データ図8bも参照）。 0 dpiでTAK-981で処理した培養物中のGFP + mCherry + T細胞の割合の同時増加が見られ（図5bでは2.62％から4.43％）、これは増殖性感染を示しています。 ここでも、TAK-981 を 6 dpi で添加しても効果はありませんでした (図 5b、拡張データ図 8b も参照)。

図5c〜eに示すように、5人の異なる献血者からの初代CD4+ T細胞を使用した5つの独立した生物学的複製から編集されたデータを示し、GFP+ mCherry+ T細胞の数が一貫して増加し（図5c）、一貫した増加が見られました。分析されたすべての実験における GFP- mCherry+ 細胞の数の減少 (図 5d)。 全体として、TAK-981 を 0 dpi で添加すると、増殖的に感染した GFP+ mCherry+ 細胞の数が 1.62 ± 0.024 倍増加し (P < 0.0001)、潜在的に感染した GFP- mCherry+ 細胞の数が 0.55 ± 0.115 倍減少しました (P = 0.007) (図 5f)。 GFP+ mCherry+ 細胞の増加は、GFP- mCherry+ 集団だけでなく GFP- mCherry- 集団にも由来し、0 dpi で TAK-981 で処理した培養物では緩やかではあるが大幅に減少しました（図 5e、f、全体の比率） 0.98 ± 0.006、P = 0.047)。 したがって、0 dpi での TAK-981 処理は、LTR および EF1-α プロモーターの両方がエピジェネティックにサイレンシングされている細胞の生成も阻害します。

今回我々は、ヒトSMC5/6複合体がクロマチン化されて組み込まれていないHIV-1 DNAのSUMO化を誘導し、そのエピジェネティックなサイレンシングを引き起こすことを示す。 その結果、SMC5/6 発現の損失、または阻害剤 TAK-981 を使用したクロマチン SUMO 化の阻害により、組み込まれていない HIV-1 DNA からの遺伝子発現が回復され、さらに IN-HIV-1 が培養 T 細胞で感染を拡大することさえ可能になります (図1）。 驚くべきことに、SMC5/6発現の喪失、またはTAK-981による治療が、CEM-SS T細胞株と初代CD4+ T細胞の両方におけるHIV-1潜伏期の確立を顕著に阻害することも実証しました（図4および5）。 ）。

抗レトロウイルス療法はエイズ患者のウイルス量を検出レベル以下に減らすことができますが、これらの薬は HIV-1 を治癒することはできません。 これは、転写的に不活性でありながら外部刺激によって活性化されてウイルス複製を再燃させることができる、完全な統合型 HIV-1 プロウイルスを含む少数の潜在感染 T 細胞が継続的に存在するためです 32。 潜在的な HIV-1 を活性化し、抗レトロウイルス療法の存在下で体内の感染性ウイルスを除去できる LRA を開発するために多大な努力が費やされてきましたが、この取り組みはこれまでのところ、効果のある LRA と効果のない LRA を特定することはできていません。 -有毒。

潜在的リザーバーは、休止メモリー T 細胞への復帰と同時に HIV-1 に感染する活性化 T 細胞に起因すると考えられています 32。 しかし、HIV-1 潜伏期間は、in vitro で CD4 T 細胞株と活性化 T 細胞の両方で確立される可能性があり 28,31、抗レトロウイルス療法を受けている患者の潜在リザーバーのほとんどはクローン増殖を通じて維持されます 33,34,35,36。増殖マーカー HLA-DR37、38、CD2539 および CD6940 を発現する細胞。 したがって、潜伏期における HIV-1 遺伝子発現の抑制は、単に休止中のメモリー T 細胞の静止状態の結果ではありません。 潜伏期は、HIV-1 プロウイルスがヘテロクロマチン領域に組み込まれ、エピジェネティックなサイレンシングが引き起こされることによって生じるとも提唱されています 41。 しかし、患者における個々の潜在的な HIV-1 組み込み部位の分析では、無傷の全長 HIV-1 プロウイルスのほとんどが、活発に転写される遺伝子に組み込まれていることが示されています 42、43、44、45、46。 全体として、HIV-1 潜伏期間の確立の根底にあるメカニズムは依然としてとらえどころのないままであり、ウイルス潜伏期間を促進する細胞因子はほとんど未定義です。

我々のデータは、HIV-1 潜伏期間の開始の根底にある重要なメカニズムが、組み込み後に既存の抑制性エピジェネティック修飾を保持する未統合プロウイルスの SMC5/6 によるエピジェネティック サイレンシングであることを示唆しています。 これらのデータは、SMC5/6 複合体が HIV-1 潜伏期の確立の促進に直接関与していることを特定し、潜伏期は侵入レトロウイルスの固有の特性からではなく、おそらく細胞の自然免疫応答の不幸な副作用から生じることを示唆しています。侵入する外来 DNA を沈黙させるために進化しました。

ヒト 293T 細胞 (メス) は、最初に American Type Culture Collection (ATCC) から購入し、10% ウシ胎児血清 (FBS、Hyclone) および抗生物質抗真菌剤 (Gibco) を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、Sigma) で培養しました。 ）。

ヒト CEM-SS 細胞 (メス) は NIH AIDS 試薬から入手し、10% FBS および抗生物質抗真菌剤を補充した Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 培地で培養しました。

Cas9 タンパク質を安定して発現する CEM-SS 細胞は、Mohan Babu から贈られた改変型 pLentiCrispr v2-Blast プラスミド (Addgene プラスミド 83480) を使用して作製されました。 U6プロモーター、sgRNA足場およびEF1-αプロモーターを、KpnIおよびAgeIによる切断によってpLentiCrispr v2-Blastから切除し、SFFVプロモーターで置き換えた。 ポリエチレンイミンを使用して、15 cm ディッシュ内の 5 × 106 個の 293T 細胞に 15 μg のレンチウイルス ベクター、およびそれぞれ 10 μg と 5 μg のパッケージング プラスミド pCMVR8.74 および pMD2.G をトランスフェクトすることにより、この構築物からレンチウイルスを作成しました。 (PEI)。 トランスフェクション(hpt)の24時間後に培地を交換した。 レンチウイルス粒子を含む上清を 72 hpt で収集し、0.44 μm フィルターで濾過し、100,000 MWCO 濃縮器 (Amicon) に通しました。 濃縮後、5 × 106 CEM-SS 細胞を 2 ml の濃縮上清とともに 37 °C で一晩インキュベートしました。 次いで、培地を新鮮なRPMI培地と交換し、細胞を48時間インキュベートした。 この時点で、形質導入細胞の選択を可能にするために、培地を20μg ml-1のブラストサイジン(Santa Cruz)を補充した新鮮なRPMI培地と交換した。 次に、各ウェルに細胞が存在する可能性が約 10% になるように、96 ウェル プレートに限界希釈液を分注することにより、細胞を単一細胞クローン化しました。 次に、これらのクローン化細胞の Cas9 活性を分析しました。

健康なドナーからのヒト血液はガルフコースト地域血液センターから購入されました。 すべてのドナーは HIV-1 および HIV-2 の検査で陰性でした。 サンプルは購入前に匿名化されました。 末梢血単核球 (PBMC) を Histopaque (Sigma) での密度勾配遠心分離によって全血から単離し、CD4+ 細胞を CD4+ 単離キット (Invitrogen) を使用して単離しました。 単離された CD4+ 細胞は、前述のように、10% FBS および IL-2 を添加した RPMI 中で、CD28/CD49d に対する抗体 (BD Biosciences) および 5 μg ml-1 フィトヘマグルチニン (PHA) とインキュベートすることによって活性化されました 47。 HIV-1 感染前の 1 週間、IL-2、CD28/CD49d 抗体および PHA の存在下で細胞を 105 ～ 106 細胞/ml に維持しました。

HIV-1 ナノルシフェラーゼ レポーター ウイルス (NL-NLuc) は、NL4-3 のウイルス nef 遺伝子を NLuc インジケーター遺伝子で置換することによって、親 NL4-3 ウイルスから生成されました 48。 NL-NLucΔEnv は、複製を不能にする env 遺伝子の 943 bp セグメントを除去することにより、NL-NLuc から作成されました。 同様に、GFP レポーター ウイルス (NL-GFPΔEnv) は、nef の代わりに GFP を置換することによって NL-NLucΔEnv から生成されました。 NL-DC レポーター ウイルスは、HIV-1 LTR の制御下で eGFP と内部 EF1-α プロモーターからの mCherry を発現し、NL-DC の GFP の 3 ' に位置する XhoI 部位に EF1-α:mCherry カセットをクローニングすることによって生成されました。 GFPΔ環境これらのレポーター ウイルスはすべて、完全な vpr 遺伝子を持っています。

機能的 Vpr タンパク質を欠く GFP レポーター ウイルス、IN- NL-GFPΔVpr は、Vif 終止コドンの 15 bp 3' に TTAA 重複を挿入することによって親 IN- NL-GFP ウイルスから作成されました。 これにより、Vpr オープンリーディングフレームの初期に終止コドンとフレームシフト変異が導入され、機能しない短縮型 Vpr タンパク質が生成されます 49。 これらのウイルスは、WT インテグラーゼ (IN+) を持っているか、IN 機能をブロックする D64V (IN-) 変異を含んでいます。

複製コンピテント NL-NLuc プロウイルスを発現するプラスミドを、PEI を使用して 293T 細胞にトランスフェクトしました。 非拡散NL-NLucΔEnvおよびNL-GFPΔEnvプロウイルスを、VSV-Gタンパク質をコードするpMD2.Gプラスミドとともに293T細胞に同時トランスフェクトした。 24 時間後、使用済み培地を新しい培地と交換しました。 72 hpt で、上清培地を 0.44 μm フィルターで濾過しました。 WT または IN- HIV-1 を含む上清培地を、標的細胞の感染に使用する前に、ELISA で測定した p24 レベルで正規化しました。 MOI:p24 正規化体積比は、106 個の CEM-SS 細胞を IN+ NL-GFPΔEnv、または CEM-SS 誘導性 Tax 細胞株 (未統合 HIV からの遺伝子発現を活性化することが知られている HTLV-1 Tax タンパク質を発現) に感染させることによって評価されました。 -110) IN− NL-GFPΔEnv を使用。 これらの細胞をさまざまな希釈のウイルスで感染させ、その後 2 dpi でフローサイトメトリーによって分析しました (拡張データ図 9 に概要を示したゲート戦略)。 次に、各希釈における GFP+ 細胞の数を、式 MOI = -ln (GFP+ 細胞の 1- 割合) を使用して MOI に変換し、ウイルスストック内の p24 レベルと相関させました。 したがって、各 MOI で使用された IN- ウイルスの量 (細胞 100 万個あたり) を決定できます。

Brunello ヒト CRISPR ノックアウト ライブラリー (Addgene 73178)15 を使用してエレクトロコンピテント細胞 (Endura) を形質転換しました。 ライブラリー (水に再懸濁) のうち、500 ng を使用して 1 mm キュベット (10 μF、600 Ω、1.8 kV) 内の合計 4 × 25 μl の細胞を形質転換し、各 sgRNA が確実に含まれるようにプレーティングしたときに >108 個のコロニーを生成しました。ライブラリ内のカバー数は平均約 1,000 倍でした。 これらのコロニーを収集し、プールしたライブラリープラスミドを Maxiprep カラム (Zymo) を使用して抽出しました。

レンチウイルスライブラリーは、PEIを使用してライブラリーDNAおよびパッケージングプラスミドpCMVR8.74およびpMD2.Gを293T細胞にトランスフェクトすることによって作成されました。 培地を24hptで交換し、レンチウイルスライブラリを含む上清を回収し、0.44μmフィルターを通して72hptで濾過した。 レンチウイルスを滴定し、CEM-SS Cas9 細胞に形質導入するために使用し、その後、2 dpt でピューロマイシン (Gemini) 死滅曲線に供し、MOI 0.3 と相関するレンチウイルスの量を決定しました。 次いで、この量を使用して108個のCEM-SS Cas9細胞を0.3MOIで形質導入し、細胞を1μg ml-1ピューロマイシン中で2dptで1週間選択した。

次いで、プールしたノックアウト細胞を、インテグラーゼ遺伝子に不活性化するD64Vアミノ酸置換を有するIN-HIV-1 NL-GFPレポーターウイルスを用いて2日間感染させた。 次いで、これらの感染細胞をBSL-3含有FACS Aria II (BD Biosciences)に通してGFP+細胞集団を収集し、そこからゲノムDNAを抽出した。 精製した gDNA を制限酵素 DpnI とインキュベートして、残留プラスミド汚染を除去しました。

この DNA からの sgRNA を、フランキングプライマー (FP: 5'-TGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGA -3' RP: 5'-GGCTCGAGGGGGCCCGGGTGCAAAGATGGATA -3') を使用した PCR によって増幅し、NdeI および XmaI 制限部位を介して親 pLentiGuide Puro プラスミドにクローニングして戻しました。 後続のラウンドの形質転換、レンチウイルス産生、形質導入および感染を記載どおりに合計3ラウンド実施した。 最終ラウンドでは、インデックス付き Illumina シーケンスプライマーを使用して DNA を増幅し、PCR 精製スピンカラム (Zymo) で精製し、NovaSeq 6000 でシーケンスしました。

シーケンスデータは、MAGECK-VISPR50 を使用して分析されました。まず、「mageck count」を呼び出して sgRNA リードカウントを生成し、sgRNA 濃縮を分析し、正規化されたリードカウントに対する Robust Rank Aggregation アルゴリズムを使用して遺伝子ランクを取得しました。 「Mageck テスト」は、以前に提案されているように、「–remove-zero Both –remove-zero-threshold 0」パラメータを使用して実行されました51。

単一遺伝子ノックアウト細胞は、目的の sgRNA を発現する pLentiGuide-Puro プラスミド (Addgene 52963)52 から作製したレンチウイルスを CEM-SS Cas9 細胞に形質導入することによって生成されました。 形質導入細胞を、1μg ml-1ピューロマイシンを1週間用いて2dptで選択した。 ポリクローナルノックアウト細胞の感染実験は、この段階で細胞を感染させることによって実行されました。

クローン細胞は、ピューロマイシン耐性細胞を限界希釈で96ウェルプレートに等分し、その後単離および増殖させることによって単離した。 次に、遺伝子病変のクローン配列決定およびウェスタンブロットによって、ノックアウト細胞が同定され、検証されました。

細胞を収集し、Laemmli バッファーで溶解し、超音波処理し、95 °C で 15 分間変性させました。 ライセートを 4 ～ 20% SDS ポリアクリルアミドゲル (Bio-Rad) で電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、次に PBS + 0.1% Tween 中の 5% ミルクでブロックしました。 膜を、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ中の５％ミルクで希釈した一次抗体および二次抗体中でそれぞれ２時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄した。 膜をルミノールベースの強化化学発光基質とともにインキュベートし、GeneSnap (Syngene) を使用してシグナルを視覚化しました。 メンブレンは、SMC5 (研究リソース識別子 RRID:AB_2900565)、SMC6 (RRID:AB_2747157)、NSMCE2 (RRID:AB_10637854)、NSMCE4A (RRID:AB_11169701)、SLF1 (RRID:AB_10816722)、SLF2 ( RRID:AB_11129755)、FLAG (RRID:AB_259529)、またはアクチン (RRID:AB_2687938)。 1:5,000で使用したアクチン抗体を除き、一次抗体は1:1,000の希釈で使用しました。 二次 HRP 結合抗マウス (RRID:AB258431) または抗ウサギ (RRID:AB_258284) 抗体を 1:5,000 希釈で使用しました。

細胞を収集し、PBSで洗浄し、PBS中の1%パラホルムアルデヒドで10分間固定した後、PBS中の2%ウシ血清アルブミン(BSA)に再懸濁し、セルストレーナーに通した。 細胞をFortessa X20フローサイトメーター(BD Biosciences)に通し、データをFlowJo v10.6.2を使用して分析した。

細胞を収集し、PBSで3回洗浄し、パッシブ溶解バッファー(Promega)で溶解し、Lumat LB9507照度計(Bertold Technologies)でNano-Gloルシフェラーゼアッセイを使用してNLuc活性をアッセイした。

親Cas9細胞株、またはΔSMC5細胞株およびΔSLF2細胞株からの細胞(107個)を、合計20mlのRPMI中でWTまたはIN-NL-NLucウイルスのいずれかに感染させた。 ウイルスストックを5 U ml-1 DNase Iで前処理して残留プラスミドDNAを除去し、すべてのIN-感染は復帰突然変異を防ぐために20 μM ラルテグラビルの存在下で実施しました。 可能であれば1、2、3、5、7、10、12、14および16 dpiで細胞をカウントし、細胞数を1mlあたり106細胞未満に維持するために培地を定期的に交換した。 生細胞 (106 個) を各時点 (可能な場合) で収集し、NLuc のアッセイと DNA および RNA の抽出のために均等に分割しました。

DNA 分析では、細胞をペレット化し、氷冷 PBS で 3 回洗浄しました。 次いで、製造業者の指示に従って、DNA Miniprep Plus カラム (Zymo) を使用して DNA を抽出し、その後、DpnI (NEB) とともにインキュベートして、残留プラスミド汚染を除去した。

RNA 分析では、細胞を TRIzol (Thermo Fisher) で溶解して RNA を収集し、DNAse I 処理して残留 DNA 汚染を除去しました。 次に、High Capacity cDNA Reverse Transcription キット (Applied Biosystems) を使用して、RNA を相補 DNA に変換しました。

総 HIV-1 DNA および RNA の定量は、HIV-1 上の U5-gag 領域を増幅するカスタム総 HIV-1 TaqMan プローブを使用して、QuantStudio 6 Pro リアルタイム qPCR マシン (Thermo Fisher) で実行されました。

Alu-LTR リアルタイム ネステッド qPCR では、ネステッド PCR アプローチを使用して DNA を増幅しました18。 簡単に説明すると、プライマー ALU1 (5'-TCCCAGCTACTGGGGAGGCTGAGG-3')、ALU2 (5'-GCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACA-3') および L-HIV (5'-ATGCCACGTAAGCGAAACTTAAGCCTCAATAAAGCTTGC-3') を使用した最初の非飽和 PCR を、 HIV-1 に感染した細胞。 PCR Kleen キット (Bio-Rad) を使用して PCR 産物を精製した後、プライマー AA55M (5'- GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAA-3') および L (5'- ATGCCACGTAAGCGAAAC-3') および SYBR グリーン マスター ミックスを使用してネステッド qPCR を実行しました。 （サーモフィッシャー）。

組み込まれていない 2LTR HIV-1 環状 DNA の量を、2LTR 環内にのみ存在する U5-U3 接合部を越えて増幅する TaqMan プライマー/プローブを使用した qPCR によって定量しました (FP: 5'- AACTAGGGAACCCACTGCTTAAG -3'、RP: 5'- TCCACAGATCAAGGATATCTTGTC - ３’、プローブ：５’−ＦＡＭ−ＡＣＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴ−ＴＡＭＲＡ−３’）５３。

次に、ゲノム β-アクチン (DNA) またはスプライスされた β-アクチン (RNA) プローブを使用して、β-アクチンを内部対照として ΔΔCT 法を使用した相対定量を実行しました。 次に、内部対照としてβ-アクチンを使用したΔΔCT法54を使用した相対定量を実行しました。

示された細胞をRPMI中で1ml当たり106細胞で培養し、IN-NL-GFPに感染させた。 ウイルスストックを5 U ml-1 DNase Iとプレインキュベートして、感染前にプラスミドの汚染を除去しました。

感染後の指定の時間に細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、1%ホルムアルデヒドで25℃で15分間架橋させた後、0.125Mグリシンで5分間クエンチしました。 次に、すすいだ細胞を ChIP 溶解バッファー (50 mM Tris-HCl pH 8.0、1% ドデシル硫酸ナトリウム、10 mM EDTA) で溶解し、Fisher Sonic Dismembrator 60 (出力 4.5、20 秒パルスを 6 回繰り返した) を使用して氷上で超音波処理しました。各超音波処理の間に 40 秒の氷を入れます)。 超音波処理したクロマチンを含む上清を、変性サケ精子 DNA (Invitrogen) で前処理した磁性プロテイン G ダイナビーズ (Thermo Fisher) を添加することによって事前に除去しました。 磁気ビーズを除去し、超音波処理したクロマチンを、ChIP 希釈バッファー (16.7 mM Tris-HCL pH 8.0、1% Triton X-100、0.01% SDS、150 mM) 中で指定の抗体 2.5 μg を使用して 4 °C で一晩インキュベートしました。 NaCl、1.2 mM EDTA)。 超音波処理したクロマチン (5%) は、逆架橋ステップまでさらなる処理を行わずに入力 DNA として保存されました。

次に、プロテイン G ダイナビーズをクロマチン抗体混合物に添加し、4 °C で 2 時間インキュベートし、ChIP LiCl バッファー (10 mM Tris-HCL pH 8.0、1% NP-40、250 mM LiCl、1 mM EDTA、1% デオキシコール酸ナトリウム) で洗浄し、TE 緩衝液 (10 mM Tris-HCL pH 8.0、1 mM EDTA) で 2 回洗浄しました。 タンパク質-DNA 複合体を溶出バッファー (0.1 M NaHCO3、1% SDS) でビーズから溶出し、65 °C で 16 時間、95 °C で 15 分間インキュベートして脱架橋し、その後 50 μg を添加して消化しました。プロテイナーゼ K を添加し、50 °C で 3 時間インキュベートします。 DNA Miniprep Plus キット (Zymo) を使用して DNA を抽出し、DpnI (NEB) で消化してプラスミドの汚染を除去した後、HIV-1 プロモーター (FP: 5'- CTCTCTGGTTAGACCAGATC) 上の U5-R を増幅するプライマーを使用して qPCR 分析に使用しました。 -3'、RP:5'-GCTAGAGATTTTCCACACTG-3')。 ChIP データは、入力 DNA のパーセンテージとして表されます。

CEM-SS ΔNSMCE2 ノックアウト細胞で発現される sgRNA による切断に耐性のある FLAG タグ付き NSMCE2 タンパク質を発現するレンチウイルス ベクターは、発現プラスミド (OHu31586、GenScript) の NSMCE2 配列をオーバーラップエクステンション PCR によって変異させて同義遺伝子を導入することによって作成されました。 sgRNA ターゲット配列への TC および CT の変異 (GTATCAACTCTGGTATGGAC から GcATtAACTCTGGTATGGAC)。 次に、この変異体 FLAG-NSMCE2 PCR 産物を、NheI および XhoI 制限部位を使用して pLCE レンチウイルス ベクターにクローニングしました。

同様に、NSMCE2ΔSUMO 変異体は、E3 SUMO リガーゼ機能に必要な RING ドメインに C185S および H187Q アミノ酸置換を導入するオーバーラップ エクステンション PCR を使用して作成されました 25。

レンチウイルスを pLCE (コントロール)、pLCE FLAG-NSMCE2、および pLCE FLAG-NSMCE2ΔSUMO から作成し、これらを CEM-SS または CEM-SS ΔNSMCE2 細胞に形質導入するために使用しました。 これらの細胞に IN+/IN- NL-NLuc または IN- NL-GFP を 0.3 MOI で感染させ、それぞれの NLuc アッセイ (NL-NLuc) またはフローサイトメトリーおよび ChIP-qPCR (NL) のために細胞を 2 dpi で収集しました。 -GFP)。 これらの NSMCE2 構築物の発現は、ウェスタンブロットによって検証されました。

TAK-981 (MedChemExpress) は SUMO 化 26 の包括的阻害剤であり、DMSO で 5 mM ストックに再構成されました。 NL-NLuc を感染させた CEM-SS Cas9 および ΔSMC5 細胞に TAK-981 を 0、5、15、30、75、150、500 および 1,000 nM 濃度で添加し、2 dpi 後に NLuc アッセイのために細胞を収集しました。

感染細胞におけるウイルスRNA発現に対するTAK-981の効果をアッセイするために、150nM TAK-981の存在下または非存在下でCEM-SS細胞をIN+/IN- NL-NLucに感染させた。 TRIzol (Thermo Fisher) を使用して 2 dpi で RNA を抽出し、DNase I で 2 時間処理しました。 次に、High Capacity cDNA Reverse Transcription キット (Applied Biosystems) を使用して cDNA を作成しました。 スプライスされていない HIV-1 RNA gag またはドナー 1 アクセプター 1 (A1D1) およびスプライスドナー 7 アクセプター 4 (A4D7) からのスプライスされたウイルス RNA のレベルを、gag 用のプライマー (FP: 5'-GCGAGAGCGTCGGTATTAAGCG-3') を使用して qPCR によって定量しました。 、RP：5'-AATCGTTCTAGCTCCCTGCTTGC-3'）、A1D1（FP：5'-GATCTCTCGACGCAGGACTC-3'、RP：5'-TGGTCCTTTCCAAACTGGAT-3'）およびA4D7（FP：5'-CAAGCTTCTCTATCAAAGCAACC -3'、RP：5） '- AATCGAATGGATCTGTCTCTGTC -3')55。

感染細胞におけるウイルス遺伝子発現およびエピジェネティック修飾に対する SUMO 化阻害の動態を理解するために、感染時または感染 16、19、21、24、36 時に 150 nM TAK-981 を CEM-SS Cas9 および ΔSMC5 細胞に添加しました。そして48hpi。 細胞を NL-NLuc Δenv に感染させ、NLuc アッセイまたは抗 SUMO2/3、H3Ac、または H3K9me3 抗体を使用した ChIP-qPCR のために 72 hpi で収集し、U5-R 領域 (FP) を増幅するプライマーを使用して HIV-1 プロモーターを定量しました。 ：5'-CTCTCTGGTTAGACCAGATC-3'、RP：5'-GCTAGAGATTTTCCACACTG-3'）。 ChIP データは、入力 DNA のパーセンテージとして表されます。

WT または ΔSMC5 CEM-SS 細胞を、150 nM TAK-981 の存在下または非存在下で ~0.1 の MOI で IN+ NL-GFPΔEnv ウイルスに感染させました。 後期感染事象を阻害するためにネビラピンを2 dpiで細胞に添加し、3 dpiで細胞を洗浄し、BSL-3含有FACS Aria II (BD Biosciences)で選別するためにPBS中の2% BSAに再懸濁してGFPを単離した。 − 細胞。 これらの細胞を増殖培地中で6日間(9 dpi)回復させた後、DMSO、150 nM TAK-981、80 nM PMAまたは1 ng ml-1 TNF-αで処理しました。 翌日（10 dpi）細胞を収集し、フローサイトメトリーによってGFP発現を分析しました。

WTまたはΔSMC5 CEM-SS細胞を、500nMラルテグラビルの存在下または非存在下でIN+ NL-GFPΔEnvウイルスに感染させた。 2 dpi で、すべての細胞を PBS で 3 回洗浄し、ネビラピンを含む RPMI に再播種し、さらに 3 日間培養しました。 5 dpi で GFP- 細胞を選別し、増殖培地で 6 日間回復させ、DMSO、PMA、または TNF-α (11 dpi) で処理し、翌日 (12 dpi) フローサイトメトリーで分析しました。

CEM-SSコントロール細胞とΔSMC5細胞の両方に、5 dpiでCEM-SS細胞+Ral（〜0.45 MOI）および-Ral（0.1 MOI）で10％のGFP + 細胞が得られるように事前に滴定された正規化されたp24量を感染させました。

PBMC から単離した活性化初代 T 細胞を、HIV-1 LTR から eGFP を発現する IN+ NL-DC レポーター ウイルス、および内部 EF1-α プロモーターから mCherry を発現する IN+ NL-DC レポーター ウイルスを約 0.05 の低 MOI で感染させました。 感染は、感染時に添加した 150 nM TAK-981 の存在下または非存在下で、または潜伏細胞における HIV-1 のエピジェネティックなサイレンシングを逆転させることが知られている 80 nM PMA 56 または収集の 24 時間前に添加した 150 nM TAK-981 の存在下で実施しました。 フローサイトメトリー用に細胞をPBS中2% BSA中で7 dpiで収集し、eGFPおよびmCherry蛍光を測定しました。 CD4+ T 細胞集団は、前方散乱分析および側方散乱分析でゲートを設定することにより、死細胞および細胞破片から分離されました。 CD4 陽性分離キット (Invitrogen) による高度な濃縮により、濃縮された CD4+ T 細胞集団を特定することもでき、存在する可能性のある少数の CD4+ 単球を除外するためにゲーティングが行われました。 次に、フローサイトメトリー データを FlowJo v10.6.2 を使用して分析しました。

また、これらの細胞から DNA を 2、3、5、および 7 dpi で抽出し、DpnI とインキュベートして残留 HIV-1 プラスミド夾雑物を除去し、その後、前のセクションで説明したように、組み込まれていない 2LTR HIV-1 環状 DNA の量を qPCR によって定量しました。

サンプルサイズと P 値はテキストまたは図の凡例に示されています。 実験のエラーバーは、独立した実験からの平均の標準偏差を表します。 統計分析は、GraphPad Prism を使用して実行されるか、CRISPR ノックアウト スクリーニングの分析で使用される指定の計算ツールによって報告されます。 統計手法に関する情報は、図の凡例に記載されています。

この研究で生成されたすべての固有の材料は、主任担当者への合理的な要求に応じて利用可能になり、NIH AIDS 試薬プログラムを通じても利用可能になります。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付けるデータは、要求に応じて責任著者から入手できます。 この研究で生成された配列決定データは、データセット識別子 SRR18245559 (CRISPR Knockout Screen) で NCBI Sequence Read Archive から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、BRC への NIH 助成金 R21-AI157616 によって支援され、Duke CFAR (P30-AI064518) からインフラストラクチャ支援を受けました。

米国ノースカロライナ州ダーラムのデューク大学医療センター、分子遺伝学および微生物学部

イシャク・D・アーワン、ハル・P・ボガード、ブライアン・R・カレン

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BRC がこのプロジェクトを発案しました。 IDI と BRC は実験を設計しました。 IDI と HPB が実験を実施しました。 IDIとBRCはデータを分析した。 IDI と BRC は HPB からの情報をもとに原稿を執筆しました

ブライアン・R・カレンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(ab) 示された遺伝子に特異的な 2 つの異なる sgRNA で形質導入され、その後 (A) IN-NL-GFPΔEnv および (B) IN-NL-NLucΔEnv レポーター ウイルスに感染した CEM-SS Cas9 細胞のポリクローナル集団。 Aの%GFP + 細胞は、2dpiでのフローサイトメトリーによって決定されました。 B における NLuc 発現は、1.0 に設定されたスクランブル sgRNA で形質導入された CEM-SS Cas9 細胞に対して正規化されました。 パネル B に示すデータは、SD を示した 3 つの生物学的複製の平均を表します。

ソースデータ

示された各クローンノックアウト細胞株を溶解し、次に示された SMC5/6 複合体成分に特異的な市販の抗体を使用したウェスタンブロット分析に供しました。 アクチンをローディングコントロールとして使用しました。 ここに示す代表的なブロットは、少なくとも 3 つの生物学的複製を示しています。

ソースデータ

(a) 培養中の総生細胞数をカウントした、非感染 CEM-SS Cas9 細胞、または ΔSMC5 および ΔSLF2 CEM-SS クローンの 7 日間増殖曲線。 (b、c) 示された細胞株を IN + / IN- HIV-1 に感染させ、(B) 組み込まれていない 2LTR DNA、および (c) 組み込まれた HIV-1 DNA のレベルをそれぞれ qPCR および Alu-qPCR によって定量しました。 DNA レベルは、1 dpi で IN + HIV-1 感染 CEM-SS Cas9 細胞に対して正規化し、1 に設定しました。示されたデータは、SD を示した 3 つの生物学的複製の平均を表します。 （ d ）示されたクローンノックアウトCEM-SS細胞株をIN + またはIN- NL-NLucΔEnvに感染させ、ウイルスNLuc発現を2 dpiでアッセイしました。 NLuc レベルは、IN-NL-NLucΔEnv (対照) に感染させた WT CEM-SS Cas9 細胞と比較して与えられており、1.0 に設定されています。 SD を示す 3 つの生物学的複製の平均。 データは、一元配置分散分析、フィッシャーの LSD 検定を使用して分析されました (p 値はグラフに示されています、****p < 0.0001)。

ソースデータ

示された細胞株を IN + および IN- NL-GFP に感染させ、2 dpi で ChIP-qPCR を行い、ウイルス LTR DNA に結合した活性化ヒストン修飾 H3Ac および H3K4me3 と抑制修飾 H3K9me3 および H3K27me3 のレベルを定量しました。 (a) H3Ac および (b) H3K4me3 (c) H3K9me3、(d) 総ヒストン H3、および (e) H3K27me3。 SD を示す 3 つの生物学的複製の平均。 データは二元配置分散分析、シダック検定で分析されました (****p < 0.0001; IN-H3K4me3 ΔSMC5: ***p = 0.0009; IN-H3K4me3 ΔSLF2: ***p = 0.0007)。

ソースデータ

CEM-SS コントロール細胞とΔSMC5 細胞に、等量の Vpr+ バージョンと Vpr- バージョンの IN-NL-GFPΔEnv インジケーター ウイルスを感染させ、ELISA で測定し、GFP 発現をフローサイトメトリーで 3dpi で分析しました。 (a) 代表的な実験からの蛍光プロファイル。 (b) SD を示した 3 つの独立した生物学的複製からの平均値の定量化。

ソースデータ

（ a ）WTまたはΔSMC5 CEM-SS細胞を、TAK-981の存在下または非存在下で、〜0.1のMOIでVSV-Gシュードタイプ化IN + NL-GFPΔEnvに感染させた。 細胞をFACSにより3dpiで選別し、図4aに報告する実験のためにGFP細胞(赤色でゲート)を収集した。 （ b ）WT HIV-1に感染したCEM-SS細胞において、組み込まれていないHIV-1 2LTR DNAのレベルを7dpiまでqPCRによって定量し、その後バックグラウンドレベルに低下しました。 SD を示す 3 つの生物学的複製の平均。 データは 2dpi の信号に対して正規化され、1.0 に設定されました。

ソースデータ

WTまたはΔSMC5 CEM-SS細胞を、インテグラーゼ阻害剤ラルテグラビルの存在下および非存在下でIN + NL-GFPΔEnvに感染させた。 これらの細胞は、パネル A に示すように、5dpi でソートしたときに +ral と -ral の両方の GFP + 細胞がほぼ同一になるような感染多重度 (MOI) で感染させました。2dpi で、細胞を洗浄してラルテグラビルを除去しました。再メッキして統合を可能にします。 GFP細胞をFACSにより5dpiで単離し、さらに6日間(11dpi)培養し、希釈剤(DMSO)、TAK-981、PMA、またはTNF-αで処理した。 次いで、細胞をフローサイトメトリーにより12dpiでGFP発現について分析した。 (a) 単一実験からの代表的な GFP 発現プロファイル。 (b) 3 つの独立した生物学的複製の編集。平均値を示し、SD を示します。 データは二元配置分散分析、テューキー検定によって分析されました (****p < 0.0001)。

ソースデータ

（ a ）WT HIV-1感染初代CD4 + T細胞では、2LTR環状ウイルスDNAのqPCR分析で測定したように、組み込まれていないHIV-1 DNAは2dpiでピークに達し、7dpiまでにバックグラウンドレベルまで低下します。 これらのデータは、5 人の別々の献血者から得られた CD4 + T 細胞を使用した 5 つの生物学的複製の平均を表しており、SD が示されています。 データは、1.0 に設定された 2dpi で検出された信号に対して正規化されました。 （ b ）デュアルカラーHIV-1インジケーターウイルスに感染し、6dpiで150nM TAK-981で処理した細胞と0dpiで希釈剤（DMSO）で処理した細胞における、示されたGFP / mCherry亜集団の統計分析。 感染細胞を 7dpi で収集し、FACS によって分析しました。 統計量は両側比対応のある t 検定で計算されます。

ソースデータ

生 T 細胞は、そのサイズと粒度に基づいて、前方散布図と側方散布図でゲート制御されました。 前方散乱高さと前方散乱面積のプロットで単一細胞をゲートし、ダブレットを除去しました。 GFP + および/または GFP - 細胞のゲートは非感染コントロールに従って定義されており、最終的な図で明らかです。

補足情報。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

未処理のウェスタンブロット。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

未処理のウェスタンブロット。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

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転載と許可

Irwan, ID、Bogerd, HP & Cullen, BR SMC5/6 複合体によるエピジェネティックなサイレンシングは、HIV-1 の潜伏期間を媒介します。 Nat Microbiol 7、2101–2113 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41564-022-01264-z

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受信日: 2022 年 5 月 23 日

受理日: 2022 年 10 月 10 日

公開日: 2022 年 11 月 14 日

発行日：2022年12月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-022-01264-z

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Nature Reviews 分子細胞生物学 (2023)