機械的刺激は Ca2+ の調節を通じて破骨細胞の機能を制御します

Oct 27, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 407 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

機械的な力の負荷は骨の恒常性を維持するために不可欠であり、負荷を解除すると骨量が減少する可能性があります。 破骨細胞は唯一の骨吸収細胞であり、骨のリモデリングにおいて重要な役割を果たします。 破骨細胞機能における機械的刺激誘発性変化の根底にある分子機構は、まだ十分に解明されていない。 我々の以前の研究では、Ca2+活性化Cl-チャネルアノクタミン1（Ano1）が破骨細胞機能の必須調節因子であることが判明した。 今回我々は、Ano1 が機械的刺激に対する破骨細胞の反応を媒介することを報告する。 インビトロでは、破骨細胞の活性は明らかに機械的ストレスの影響を受け、これには Ano1 レベル、細胞内 Cl- 濃度、Ca2+ 下流シグナル伝達の変化が伴います。 Ano1 ノックアウトまたはカルシウム結合変異体は、機械的刺激に対する破骨細胞の反応を鈍化させます。 in vivo では、破骨細胞における Ano1 ノックアウトは、負荷誘導による破骨細胞の阻害を鈍化し、負荷軽減による骨損失を鈍化させます。 これらの結果は、Ano1 が機械的刺激誘発性の破骨細胞活性変化において重要な役割を果たしていることを示しています。

骨のリモデリングは機械的刺激に大きく依存しており、これはアスリートの骨量の増加や、長時間のベッド安静 1 または宇宙飛行中の微小重力 2 の条件下での劇的な骨減少によって証明されています。 機械的ストレスは、主に骨芽細胞の数を増加させ、その活性を促進し、その補充を上方制御することによって骨量を増加させ、それによって骨形成を刺激します3,4。 逆に、機械的刺激がないと、骨形成が阻害され 5、破骨細胞形成とその後の骨吸収が促進される 6 ため、骨量が減少します。 伝統的に、骨芽細胞と骨細胞は機械的刺激の感知を担当する細胞であると考えられており、骨代謝におけるそれらの役割は広く文書化されています7、8。 それにもかかわらず、破骨細胞に対する機械的刺激の影響はほとんど報告されておらず、機械的ストレスに対する破骨細胞の応答のメカニズムはまだ十分に理解されていません。 骨粗鬆症に対する非薬物介入としてクリニックで機械的信号を効果的に利用するには、骨のリモデリングに重要な機械的負荷の構成要素を特定することが不可欠です。

機械的刺激は、生物が感知して対処しなければならない重要な環境の合図を表します5,9。 機械的な力の感知は生命のあらゆる領域で保存されており、さまざまなタンパク質が機械的な力の感知と応答に関与しています10、11、12。 そのうち、機械感受性イオンチャネルは、細胞に加えられる機械的な力によって直接活性化されます13、14。 細胞は、機械的刺激に応答して開閉するこれらの機械感受性イオンチャネルを介して、機械的刺激を電気信号または化学信号に変換します 15,16。 我々の以前の発見により、骨芽細胞における機械感受性のPiezo1チャネルが骨芽細胞における機械感受性の重要なトランスデューサーとして機能するため、骨形成に必要であることが明らかになりました8。 しかし、破骨細胞の機械感受性イオンチャネルについては、まだあまり研究されていません。

TMEM16A としても知られるアノクタミン 1 (ANO1) は、カルシウム活性化塩素チャネルとして同定されました。 ANO1 は、平滑筋細胞 17、18 およびニューロン 19 の興奮性の制御、上皮細胞による体液分泌 20、急性痛覚 21、嗅覚伝達 22、がん細胞の増殖、生存および移動 23、24 など、さまざまな細胞において重要な役割を果たしています。 我々の以前の研究では、ANO1 が破骨細胞機能の必須の調節因子であり、そのチャネル活性が RANK との相互作用に寄与し、RANKL 誘導性の下流シグナル伝達経路を促進することが示されました 25。

Ano1 のクライオ EM の構造から、各サブユニットには 10 個の膜貫通 (TM) セグメントが含まれており、TM3 ～ 8 が 1 つのイオン伝導経路を裏打ちしていることがわかります。 遠い系統関係を同定するための戦略に基づくバイオインフォマティクス分析は、Ano1 が機械感受性チャネル OSCA (高浸透圧依存性カルシウム透過性チャネル) に進化的に関連していることを示唆しています 26。 さらに、クライオ EM マップの特徴と機械感受性 OSCA チャネルと ANO1 チャネルの構造的類似性を考慮すると、ANO ファミリータンパク質は機械感受性 OSCA イオン チャネルと同じ機械感受性特性を備えていると考えられます。

この研究では、機械的刺激が破骨細胞の機能の変化をもたらし、Ano1 がこのプロセスにおいて重要な役割を果たしていることがわかりました。 流体せん断応力 (FSS) または過重力 (HG) によって誘発される機械的刺激は破骨細胞の活性を阻害し、これに伴い Ano1 レベルの低下が見られました。 逆に、模擬微小重力条件（MG）下での機械的除荷は、Ano1 レベルの増加をもたらし、その後破骨細胞の活性を促進します。 破骨細胞の ANO1 欠損は、機械的刺激に対する感受性を低下させます。 機構的には、ANO1 チャネル活性は機械的シグナル伝達によって修飾され、細胞内 Cl- 濃度とカルシウム媒介経路の変化をもたらしました。 破骨細胞における Ano1 ノックアウトは、アンロード誘発性の破骨細胞活性化を有意に阻害し、アンロード誘発性の骨損失を軽減します。 これらの結果は、Ano1 が破骨細胞が機械的刺激に応答できるようにする内因性因子であることを示しています。

破骨細胞の活動に対する機械的刺激の影響を調べるために、流体せん断応力 (FSS)、超重力 (HG)、および模擬微小重力 (MG) の 3 つの機械的力を利用して破骨細胞を刺激しました。 12 dyn / cm2 FSSと4 g HG処理を使用して機械的負荷の影響を調査し、模擬微小重力システムを使用して破骨細胞の分化と活性に対する機械的負荷の影響を調査しました（補足図1a〜c）。 マウス骨髄由来マクロファージ (BMM) を M-CSF (10 ng/ml) のみで 1 日間培養し、続いて M-CSF (30 ng/ml) および RANKL (50 ng/ml) で 1 日間培養しました。 3日と5日。 細胞は全プロセスにおいてFSS、HGおよびMGで処理されました。 我々は、破骨細胞の分化における各段階のマーカー遺伝子の発現を調べた27、28、29。 1日目に細胞をFSSで処理した場合、破骨細胞分化の初期段階のマーカー遺伝子であるインテグリンサブユニットαX（Itgax）およびCd74の発現に変化はありませんでした（補足図2a）。 3日目に、樹状細胞は7回膜貫通タンパク質（Dcstamp）を発現し、ATPase H +輸送V0サブユニットd2（Atp6v0d2）、前破骨細胞のマーカー遺伝子の発現が抑制されました（補足図2b）。 5日目には、破骨細胞活性のマーカー遺伝子である活性化T細胞核因子1（NFATc1）、酸性ホスファターゼ5（Acp5）、カテプシンK（Ctsk）およびマトリックス金属タンパク質9（Mmp9）の発現が大幅に減少した（補足図）。 .2c)。 NFATc1のタンパク質レベルは破骨細胞の分化中に増加し、FSSはNFATc1タンパク質レベルを阻害しました（図1a）。 TRAP+細胞の数は、対照破骨細胞よりもFSS処理破骨細胞で減少しました（図1b）。 HG 処理後の破骨細胞でも同様の結果が観察され、Itgax および Cd74 の発現には影響せず、Dcstamp、Atp6v0d2、NFATc1、Acp5、Ctsk、および Mmp9 の発現が下方制御され、NFATc1 タンパク質レベルが阻害され、破骨細胞の数が減少しました。 TRAP+ セル（補足図 2d–f、図 1c、d）。 微小重力は明らかに破骨細胞の分化と活性を促進し、破骨細胞分化の初期段階の遺伝子の発現は変化しませんでしたが（補足図2g）、前破骨細胞および破骨細胞の遺伝子の発現は、コントロール細胞よりもMGでの処理下で有意に高かった（補足図2g）。補足図2h、i)。 NFATc1のタンパク質レベルとTRAP+細胞の数は、対照破骨細胞よりもMG処理破骨細胞で有意に増加しました（図1e、f）。

1日、3日、または5日間の流体せん断応力（FSS）処理下での破骨細胞分化中のNFATc1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。 b 1日、3日、または5日間のFSS処理下での破骨細胞分化中のTRAP染色の代表的な画像（左）。 スケールバー、200μm。 cm2 あたりの多核細胞数の定量化 (右)。 (n = 0 ～ 231、3 つの独立した実験から)。 c 1日、3日または5日間の過重力（HG）処理下での破骨細胞分化中のNFATc1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。 d 1日、3日、または5日間のHG処理下での破骨細胞分化中のTRAP染色の代表的な画像（左）。 スケールバー、200μm。 cm2 あたりの多核細胞数の定量化 (右)。 (n = 0 ～ 291、3 つの独立した実験から)。 e 1日、3日または5日間の微小重力（MG）処理下での破骨細胞分化中のNFATc1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。 f 1日、3日、または5日間のMG処理下での破骨細胞分化中のTRAP染色の代表的な画像（左）。 スケールバー、200μm。 cm2 あたりの多核細胞数の定量化 (右)。 (n = 0 ～ 377、3 つの独立した実験から)。 g 1日、3日または5日間のFSS処理下での破骨細胞分化中のAno1 mRNAレベルのQRT-PCR分析。 (n = 3 回の独立した実験)。 h 1日、3日または5日間のFSS処理下での破骨細胞分化中のAno1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。 i 1日、3日または5日間のHG処理下での破骨細胞分化中のAno1 mRNAレベルのQRT-PCR分析。 (n = 3 回の独立した実験)。 j 1日、3日または5日間のHG処理下での破骨細胞分化中のAno1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。 k 1日、3日または5日間のMG治療下での破骨細胞分化中のAno1 mRNAレベルのQRT-PCR分析。 (n = 3 回の独立した実験)。 l 1日、3日または5日間のMG処理下での破骨細胞分化中のAno1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。 すべてのデータは平均値±標準誤差です。2 つ以上のグループの統計分析は、グループ間の差異を決定するために、Šídák 事後検定を使用した二元配置分散分析 (ANOVA) で実行されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

これらの結果は、機械的な力が破骨細胞の活動に影響を与えることを示唆しました。 私たちの以前の研究では、Ano1 が破骨細胞の活動に重要な役割を果たしていることがわかりました。 Ano1 のクライオ EM マップの特徴と、Ano1 の機械感受性 OSCA との構造的類似性により、Ano1 が機械的刺激に対する破骨細胞の応答に関与しているかどうかをテストするようになりました。 FSSまたはHG治療下では、破骨細胞のAno1レベルが大幅に減少しました（図1g–j）。 MG 処理を受けると、破骨細胞の Ano1 レベルが大幅に増加しました (図 1k、l)。 これらの結果は、Ano1 が機械的刺激によって誘発される破骨細胞の活動の変化に関連していることを示唆しました。

Ano1 が破骨細胞における機械的負荷の阻害役割を媒介するかどうかを調べるために、破骨細胞特異的な条件付き Ano1 ノックアウト (Ctsk-Cre;Ano1fl/fl) マウスから破骨細胞を単離しました。 結果は、Ctsk-Cre;Ano1fl/fl破骨細胞の活性がAno1fl/fl破骨細胞の活性よりも有意に低いことを示しました（図2a〜e）。 Ano1fl/fl および Ctsk-Cre;Ano1fl/fl 破骨細胞を、それぞれ 1 日あたり 30 分間 2 日間、HG に 2 日間曝露しました。 FSS 処理後、Ano1fl/fl 破骨細胞では、Ano1 mRNA レベルが 34.53% 減少し、Ano1 のタンパク質レベルが 47.8% 減少しましたが、Ctsk-Cre;Ano1fl/fl 破骨細胞では有意な変化はありませんでした（図 2a、b） ）。 FSS処理により、Ano1fl / fl破骨細胞におけるTRAP +多核細胞の数が40.7％減少し、NFATc1、Acp5、CtskおよびMmp9の発現が大幅に減少しました（図2c〜e）。 保存されたアミノ酸残基 E702 および E705 は、Ca2+ 依存性チャネル活性化の 2 つの重要な部位であり、Ano1 活性にとって重要であることが知られています。 カルシウム結合部位が Ano1 媒介の機械的刺激において重要な役割を果たしているかどうかを調べるために、Ctsk-Cre;Ano1fl/fl 破骨細胞にベクター、野生型 Ano1 (Ano1) または変異体 Ano1 (E702/E705Q) をトランスフェクトし、その後処理しました。 FSSで。 Ctsk-Cre;Ano1fl/fl破骨細胞はFSSに応答せず、野生型Ano1はFSSに対するCtsk-Cre;Ano1fl/fl破骨細胞の応答をレスキューできますが、Ca2+結合部位変異体を持つAno1はレスキューできないことがわかりました（図2f） 。 同様に、HG処理により、Ano1 mRNAとタンパク質レベルの両方が減少し（図3a、b）、Ano1fl / fl破骨細胞の破骨細胞数が22.5％減少しましたが、Ctsk-Cre;Ano1fl / fl破骨細胞では減少しませんでした（図3a、b）。図3c、d)。 したがって、NFATc1、Acp5、CtskおよびMmp9の発現もAno1fl / fl破骨細胞では阻害されましたが、Ctsk-Cre;Ano1fl / fl破骨細胞では阻害されませんでした（図3e）。 Ctsk-Cre;Ano1fl/fl破骨細胞もHGには応答しませんでしたが、野生型Ano1はHGに対するCtsk-Cre;Ano1fl/fl破骨細胞の応答をレスキューできますが、Ca2+結合部位変異体を持つAno1はレスキューできません（図3f）。 これらのデータは、Ano1 を介した機械的負荷が破骨細胞活性の低下を誘導したことを示唆しています。

Ano1fl/fl および Ctsk-Cre における Ano1 mRNA レベルの QRT-PCR 分析。Ctrl または FSS (12 dyn/cm2、30 分/日) で 2 日間処理した後の Ano1fl/fl 破骨細胞。 (n = 3 回の独立した実験)。 b Ano1fl / flおよびCtsk-CreにおけるAno1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析; CtrlまたはFSSで処理した後のAno1fl / fl破骨細胞（左）。 破骨細胞の Ano1 タンパク質レベルの定量化 (右)。 (n = 3 回の独立した実験)。 c Ano1fl / flおよびCtsk-CreにおけるTRAP染色の代表的な画像; CtrlまたはFSS（12 dyn / cm2、30分/日）で2日間処理した後のAno1fl / fl破骨細胞。 スケールバー、200μm。 d cm2あたりの多核細胞の数の定量化。 (n = 89–231、3 つの独立した実験から)。 e CtrlまたはFSSで2日間処理した後の破骨細胞Ano1fl / flおよびCtsk-Cre;Ano1fl / fl破骨細胞におけるNFATc1、Acp5、CtskおよびMmp9 mRNAレベルのQRT-PCR分析。 (n = 3 回の独立した実験)。 f Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスから単離された破骨細胞における NFATc1、Acp5、Ctsk、および Mmp9 mRNA レベルの QRT-PCR 分析。 破骨細胞をNC、WT Ano1、または変異体Ano1 (E702/705Q)でトランスフェクトし、FSSの存在下または非存在下で2日間処理しました。 (n = 3 回の独立した実験)。すべてのデータは平均値 ± sem です。2 つ以上のグループの統計分析は、グループ間の差異を決定するための Šídák 事後検定による二元配置分散分析 (ANOVA) で実行されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

Ano1fl/fl および Ctsk-Cre における Ano1 mRNA レベルの QRT-PCR 分析。Ctrl または HG (4 g) で 2 日間処理した後の Ano1fl/fl 破骨細胞。 (n = 3 回の独立した実験)。 b Ano1fl / flおよびCtsk-CreにおけるAno1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析; CtrlまたはHGで処理した後のAno1fl / fl破骨細胞（左）。 破骨細胞の Ano1 タンパク質レベルの定量化 (右)。 (n = 3 回の独立した実験)。 c Ano1fl / flおよびCtsk-CreにおけるTRAP染色の代表的な画像;CtrlまたはHG（4g）で2日間処理した後のAno1fl / fl破骨細胞。 スケールバー、200μm。 d cm2あたりの多核細胞の数の定量化。 (n = 109–312、3 つの独立した実験から)。 e CtrlまたはHGによる処理後のAno1fl / flおよびCtsk-Cre;Ano1fl / fl破骨細胞におけるNFATc1、Acp5、CtskおよびMmp9 mRNAレベルのQRT-PCR分析。 (n = 3 回の独立した実験)。 f Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスから単離された破骨細胞における NFATc1、Acp5、Ctsk、および Mmp9 mRNA レベルの QRT-PCR 分析。 破骨細胞をNC、WT Ano1、または変異体Ano1 (E702/705Q)でトランスフェクトし、HGの存在下または非存在下で2日間処理しました。 (n = 3 回の独立した実験)。すべてのデータは平均値 ± sem です。2 つ以上のグループの統計分析は、グループ間の差異を決定するための Šídák 事後検定による二元配置分散分析 (ANOVA) で実行されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

破骨細胞の Ano1 が in vivo での機械的負荷への応答に関与しているかどうかを調べるために、生後 16 週齢の雌 Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスおよび Ano1fl/fl マウスの左脛骨に、骨幹中央部で +1200 μɛ のピークひずみを負荷しました 30。 。 TRAP染色により、2週間の機械的負荷により、Ano1fl / flマウスの脛骨のOc.S / BSおよびN.Oc / B.Pmが減少しましたが、Ctsk-Cre;Ano1fl / flマウスでは減少しなかったことが示されました（補足図3a、b）。 NFATc1、Acp5、CtskおよびMmp9の発現は、機械的負荷で処理したAno1fl / flマウスの骨では特異的に減少しましたが、Ctsk-Cre;Ano1fl / flマウスでは減少しませんでした（補足図3c、d）。 これらの結果は、破骨細胞の Ano1 が機械的負荷に対する骨の応答において重要な役割を果たしていることを示唆しています。

Ano1 が機械的除荷に対する破骨細胞の応答を媒介するかどうかを調べるために、Ano1fl/fl マウスおよび Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスの破骨細胞を除荷処理に供しました。 MGで2日間処理した後、Ano1のmRNAおよびタンパク質レベルは、Ano1fl / fl破骨細胞でそれぞれ2.7倍と2倍有意に増加しましたが、Ctsk-Cre;Ano1fl / fl破骨細胞では増加しませんでした（図4a、 b）。 MG処理により、TRAP +多核細胞の数が2倍増加し、Ano1fl / fl破骨細胞の破骨細胞マーカー遺伝子の発現が有意に増加しましたが、Ctsk-Cre;Ano1fl / fl破骨細胞では増加しませんでした（図4c〜e）。 同様に、野生型 Ano1 は、MG に対する Ctsk-Cre;Ano1fl/fl 破骨細胞の応答をレスキューできますが、Ca2+ 結合部位変異体を持つ Ano1 はレスキューできません (図 4f)。これらのデータは、破骨細胞における Ano1 ノックアウトが、破骨細胞の機械的負荷軽減によって誘発される機械的負荷を排除することを示唆しています。破骨細胞の活性の増強。

Ano1fl/fl および Ctsk-Cre における Ano1 mRNA レベルの QRT-PCR 分析。Ctrl または MG で 2 日間処理した後の Ano1fl/fl 破骨細胞。 (n = 3 回の独立した実験)。 b Ano1fl / flおよびCtsk-CreにおけるAno1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析; CtrlまたはMGで2日間処理した後のAno1fl / fl破骨細胞（左）。 破骨細胞の Ano1 タンパク質レベルの定量化 (右)。 (n = 3 回の独立した実験)。 c Ano1fl / flおよびCtsk-CreにおけるTRAP染色の代表的な画像;CtrlまたはMGで2日間処理した後のAno1fl / fl破骨細胞。 スケールバー、200μm。 d cm2あたりの多核細胞の数の定量化。 (n = 130–453、6 つの独立した実験から)。 e CtrlまたはMGによる処理後の破骨細胞Ano1fl / flおよびCtsk-Cre;Ano1fl / fl破骨細胞におけるNFATc1、Acp5、CtskおよびMmp9 mRNAレベルのQRT-PCR分析。 (n = 3 回の独立した実験)。 f Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスから単離された破骨細胞における NFATc1、Acp5、Ctsk、および Mmp9 mRNA レベルの QRT-PCR 分析。 破骨細胞をNC、WT Ano1、または変異体Ano1 (E702/705Q)でトランスフェクトし、MGの有無にかかわらず2日間処理しました。 (n = 3 回の独立した実験)。 すべてのデータは平均値±標準誤差です。2 つ以上のグループの統計分析は、グループ間の差異を決定するために、Šídák 事後検定を使用した二元配置分散分析 (ANOVA) で実行されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

塩化物チャネルとしての Ano1 の特性に基づいて、機械的刺激に応答した破骨細胞の細胞質 Cl- レベルの変化を調査します。 我々は Cl- センサー (蛍光プローブ、MQAE) を使用しました。このセンサーの蛍光強度は細胞内 Cl- 濃度に反比例し、蛍光強度の減少は細胞質 Cl- レベルの増加と相関します 31。 興味深いことに、FSS および HG 処理を受けた場合、Ano1fl/fl 破骨細胞では細胞内 Cl- 濃度の増加により Cl- センサーの蛍光強度が 46.5% および 42.4% 大幅に減少しましたが、Ctsk-破骨細胞では減少しませんでした。 Cre;Ano1fl/fl 破骨細胞 (図 5a、b)。 しかし、MG処理を受けると、Cl-センサーの蛍光強度は増加しましたが、Ctsk-Cre;Ano1fl/fl破骨細胞では増加しませんでした（図5c）。 これらの結果は、破骨細胞において機械的負荷が細胞内 Cl- レベルを増加させ、負荷を解除すると細胞内 Cl- レベルが低下する可能性があり、これは Ano1 によって媒介されることを示しました。

破骨細胞の細胞内塩素濃度の測定。 すべての細胞を5 mM MQAEで染色しました。 a Ano1fl/fl および Ctsk-Cre の代表的な蛍光画像。Ctrl または FSS (12 dyn/cm2、30 分/日) で 2 日間処理した後の Ano1fl/fl 破骨細胞 (左)。 スケールバー、100μm。 破骨細胞の相対蛍光強度 (右)。 (n = 3 回の独立した実験)。 b Ano1fl / flおよびCtsk-Creの代表的な蛍光画像; CtrlまたはHG（4 g）で2日間処理した後のAno1fl / fl破骨細胞（左）。 スケール バー、100 μm。破骨細胞の相対蛍光強度 (右)。 (n = 3 回の独立した実験)。 c Ano1fl / flおよびCtsk-Creの代表的な蛍光画像;CtrlまたはMGで2日間処理した後のAno1fl / fl破骨細胞（左）。 スケールバー、100μm。 破骨細胞の相対蛍光強度 (右)。 (n = 3 回の独立した実験)。 すべてのデータは平均値±標準誤差です。2 つ以上のグループの統計分析は、グループ間の差異を決定するために、Šídák 事後検定を使用した二元配置分散分析 (ANOVA) で実行されました。 **p < 0.01、***p < 0.001。

我々の以前の研究では、Ano1が破骨細胞形成中のRANKL媒介CaMKIVCreb活性化に必要であることが判明した。 Ano1 が CaMKIV-Creb シグナル伝達経路を介して機械的刺激に対する破骨細胞の応答を媒介するかどうかを判断するために、CaMKIV と Creb のリン酸化に対する機械的負荷と負荷解除の影響をテストしました。 その結果、FSSまたはHGによる処理後のAno1fl/fl破骨細胞では、CaMKIVおよびCrebのリン酸化が減少し、これに伴いNFATc1の下方制御が行われたが、Ctsk-Cre;Ano1fl/fl破骨細胞には変化がなかったことが示された（図1）。 .6a–h）。 MGによる治療後のAno1fl / fl破骨細胞では、CaMKIVおよびCrebのリン酸化、およびNFATc1タンパク質レベルがすべて増加しましたが、CtrlグループとMGグループの間でCtsk-Cre;Ano1fl / fl破骨細胞には変化はありませんでした（図6i- l）。 これらの結果は、CaMKIV-Creb-NFATc1 シグナル伝達が、破骨細胞活性に対する Ano1 媒介の機械的刺激に関与していることを示しました。

Ctrl または FSS (12 dyn/cm2、30 分/日) 治療による Ano1fl/fl および Ctsk-Cre;Ano1fl/fl 破骨細胞における p-CaMKIV、CaMKIV、p-Creb、Creb、および NFATc1 タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。 2日。 b – d 破骨細胞におけるp-CaMKIV、p-Creb、およびNFATc1タンパク質レベルの定量。 p-CaMKIV タンパク質レベルは CaMKIV に正規化され、p-Creb タンパク質レベルは Creb に正規化され、NFATc1 タンパク質レベルは Gapdh に正規化されました。 (n = 3 回の独立した実験)。 e Ano1fl / flおよびCtsk-Creにおけるp-CaMKIV、CaMKIV、p-Creb、CrebおよびNFATc1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析; CtrlまたはHG（4 g）で2日間処理したAno1fl / fl破骨細胞。 f – h 破骨細胞における p-CaMKIV、p-Creb、および NFATc1 タンパク質レベルの定量化。 p-CaMKIV タンパク質レベルは CaMKIV に正規化され、p-Creb タンパク質レベルは Creb に正規化され、NFATc1 タンパク質レベルは Gapdh に正規化されました。 (n = 3 回の独立した実験)。 i Ano1fl / flおよびCtsk-Creにおけるp-CaMKIV、CaMKIV、p-Creb、CrebおよびNFATc1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析;CtrlまたはMG処理を2日間行ったAno1fl/fl破骨細胞。 j–l 破骨細胞における p-CaMKIV、p-Creb、および NFATc1 タンパク質レベルの定量化。 p-CaMKIV タンパク質レベルは CaMKIV に正規化され、p-Creb タンパク質レベルは Creb に正規化され、NFATc1 タンパク質レベルは Gapdh に正規化されました。 (n = 3 回の独立した実験)。 すべてのデータは平均±標準誤差です。統計分析は、グループ間の差異を決定するために、Šídák 事後検定を使用した二元配置分散分析 (ANOVA) で実行されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

Ano1 が機械的除荷による骨損失を媒介するかどうかを判断するために、後肢サスペンション (HS) モデルを使用して、体重負荷による除荷に応じた後肢の骨の変化を調べました。 生後 3 か月の Ano1fl/fl マウスと Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスを 28 日間 HS に供しました。 Ano1のmRNAおよびタンパク質レベルは、HSに曝露されたAno1fl/flマウスの骨組織において有意に増加した（図7a、b）。 マイクロ CT 分析により、組織体積に対する骨体積の比 (BV/TV)、小柱数 (Tb.N)、および小柱の厚さ (Tb.Th) などの骨梁の骨量および構造関連パラメータが大幅に減少していることが示されました。それに応じて、HSによる治療後のAno1fl/flマウスでは小柱間隔（Tb.Sp）が増加しました（図7c、d）。 HS を受けた Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスは、HS を受けた Ano1fl/fl マウスよりもはるかに高い骨梁骨量、BV/TV、Tb.N、および Tb.Th を示しました。 したがって、Tb.Spは、対照マウスよりもCtsk-Cre;Ano1fl/flマウスではるかに低かった（図7c、d）。 次に、HS 治療後の破骨細胞機能の対応する変化を分析しました。 TRAP 染色は、HS に供した Ano1fl/fl マウスにおける破骨細胞活性の明らかに増加を示しました。 しかし、HSはCtsk-Cre;Ano1fl/flマウスにおいてTRAP活性のわずかな増加のみを誘導し、Ano1fl/flマウスで観察されたものよりもはるかに弱かった（図7e）。 Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスの近位脛骨における骨表面あたりの破骨細胞表面積 (Oc.S/BS) および骨周囲あたりの破骨細胞数 (N.Oc/B.Pm) は、HS を行った Ano1fl/fl マウスよりもはるかに低かった。 Ano1fl/fl マウス (図 7f)。 したがって、CTX-1のレベルは、Ano1fl/flマウスからの血清中で顕著な増加を示しましたが、Ctsk-Cre;Ano1fl/flマウスではわずかな増加を伴いました（図7g）。 QRT-PCR分析により、HSを受けたAno1fl / fl対照マウスと比較して、HSを受けたCtsk-Cre;Ano1fl / flマウスの骨組織ではNFATc1、Acp5、CtskおよびMmp9 mRNAレベルがすべて大幅に減少していることが示されました（図7h）。 。 HS 治療後の Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスおよび Ano1fl/fl マウスにおける骨形成の変化を検証するために、安楽死の 10 日前および 2 日前にマウスにカルセインを腹腔内注射して、新骨形成を標識しました。 HS による治療後、Ano1fl/fl マウスの脛骨におけるミネラル付着率 (MAR) と骨表面あたりの骨形成率 (BFR/BS) はそれぞれ 31% と 17% 減少しました。 HS治療後のCtsk-Cre;Ano1fl / flマウスの脛骨におけるそれらのレベルは、Ctrlグループと比較してそれぞれ21％および4％減少しました（補足図4a、b）。

a、b Ctrlまたは後肢懸垂（HS）治療を受けたAno1fl / flおよびCtsk-Cre;Ano1fl / flマウスの骨組織におけるAno1 mRNAレベルのQRT-PCR分析およびAno1タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。 (各グループの n = 6)。 c 示されたマウスのグループからの遠位大腿骨のマイクロCT再構成によって決定された三次元小柱構造を示す代表的な画像。 スケールバー、0.5 mm。 d 示されたマウスのグループからの大腿骨遠位における組織体積あたりの骨体積（BV / TV）、小柱数（Tb.N）、小柱の厚さ（Tb.Th）および小柱間隔（Tb.Sp）のマイクロCT測定。 。 (各グループの n = 6)。 e 示されたマウスのグループからの近位脛骨のTRAP染色の代表的な画像。 スケールバー、50μm。 f 骨周囲あたりの破骨細胞の数（N.Oc/B.Pm）および骨表面あたりの破骨細胞表面（Oc.S/BS）に関する画像の組織形態計測分析。 (各グループの n = 6)。 g 示されたマウスのグループからの血清中のCTX-1タンパク質レベルのELISA分析。 (各グループの n = 6)。 h 示されたマウスのグループから収集された骨組織におけるNFATc1、Acp5、CtskおよびMmp9 mRNAレベルのQRT-PCR分析。 (各グループの n = 6)。 2 つ以上のグループを使用した統計分析は、グループ間の差異を決定するために、Šídák 事後検定を使用した二元配置分散分析 (ANOVA) で実行されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

この研究では、Ano1 が破骨細胞におけるこれまで同定されていなかった機械感受性チャネルであることを実証します。 われわれは、破骨細胞の機能がAno1レベルの変化を伴う機械的治療によって調節されることを発見した。 12 dyn/cm2 の流体せん断応力または 4 g の過重力条件下では、破骨細胞の活性が阻害され、Ano1 の発現が減少しました。 逆に、模擬微小重力環境は破骨細胞の活動を促進し、Ano1 のレベルを増加させます。 ここで、我々は、Ano1 機能が機械的ストレスに対する破骨細胞の応答における重要な調節因子であることを特定しました (図 8)。 さらに、機械的負荷条件下では、細胞内の塩化物イオン濃度が増加し、カルシウムシグナルが抑制されました。 一方、機械的なアンロードは細胞内の塩化物イオン濃度を低下させ、カルシウムシグナルを促進します。 細胞内 Cl- レベルは、細胞外の酸性化の維持に必要です。 破骨細胞における Ano1 ノックアウトまたは Ano1 の Ca2+ 結合部位変異体は、機械的な負荷または負荷解除に応答しませんでした。 これらの発見は、Ano1 がそのカルシウム調節チャネル活性を通じて破骨細胞において機械的センサーとして機能することを示唆しています。

Ano1 は、カルシウム制御チャネル活性を通じて破骨細胞の機械センサーとして機能します。

過去 10 年間にわたり、骨芽細胞と骨細胞が骨組織の機械的刺激に対する主な応答体であることが知られてきました。 さまざまな機械的刺激下での破骨細胞の機能の変化は、主に骨芽細胞と骨細胞に起因すると考えられています。 機械的負荷は骨芽細胞と骨細胞の機能を増加させます8,32,33。 破骨細胞形成と破骨細胞の機能は、骨芽細胞と骨細胞からの RANKL 分泌によって制御されます 34,35。 しかし、微小重力および模擬微重力の条件下では、骨芽細胞の機能が抑制され、骨量とミネラル含有量が減少し、骨の皮質および小柱の微細構造が損なわれます 32,36。 しかし、破骨細胞の機能は、地球上でも宇宙でも、骨が除荷された状況下では依然として増加します。 このことから、骨芽細胞や骨細胞の変化とは無関係に、破骨細胞が機械的刺激に敏感になれるのはどの内因性因子なのかという疑問が生じます。 イオンチャネルは、細胞膜に位置する多量体細孔形成タンパク質です。 それらは、さまざまな機械信号に応答して開閉する機能を備えています37、38、39、40、41、42。 破骨細胞の分化は、形態学的変化や遺伝子発現の変化を通じて FSS によって抑制される可能性があるという証拠があります。 以前の in vitro 研究では、破骨細胞の分化中に FSS 刺激に応答して 2 種類の機械的伝達チャネルが存在することが示されました。 具体的には、タイプ 1A 膜貫通タンパク質間質相互作用分子 1 (STIM1) は、破骨細胞分化の初期段階で FSS 誘導性の [Ca2+]i 振動を媒介する一方、一過性受容体電位 (TRP) ファミリーのメンバー TRPV4 は FSS 誘導性の Ca2+ において重要な役割を果たします。破骨細胞分化の後期段階におけるフラックスと[Ca2+]i振動43。 私たちの研究では、FSS と HG 刺激が細胞内 [Cl-]i を増加させ、破骨細胞の下流経路を活性化する Ca2+ を阻害することにより、Ano1 の発現とチャネル活性を阻害することを発見しました。 対照的に、MG 刺激は、細胞内 [Cl-]i を減少させ、下流経路を活性化する Ca2+ を活性化することにより、Ano1 発現とチャネル活性を促進します。

最近、Ano1 の低温 EM 構造が解明され、OSCA1.2 や他の OSCA ファミリー メンバーなどの機械感受性チャネルとの構造相同性が明らかになりました 41。 それらは、同様の二量体構造、膜貫通ドメイン構造、および細孔の位置を持っています26。 これらの結果は、機械感覚における Ano1 の潜在的な役割を示唆しています。 今回、機械的刺激に対する破骨細胞の応答が Ano1 に依存していることを発見しました。 Ano1 のレベルと活性は、破骨細胞に対する機械的刺激の影響を強調しています。 さらに、Ano1 の発現はさまざまな機械的刺激によって調節されます。 機械的負荷は Ano1 レベルを低下させますが、機械的負荷は Ano1 レベルを上昇させます。 破骨細胞におけるAno1ノックアウトは、機械的刺激に対する感受性を実質的に鈍化させる。 ただし、Ano1 が機械センサーであると判断するには、機械的刺激下での Ano1 チャネルの構造の変化をさらに解明する必要があります。

まとめると、破骨細胞の活動は、Ano1 レベル、細胞内 Cl- 濃度、および Ca2+ シグナル伝達の変化を伴う機械的ストレスによって明らかに影響を受けることが確立された我々の発見です。 破骨細胞特異的 Ano1 ノックアウト マウスは、破骨細胞の応答を鈍化させることにより、除荷誘発性の骨量減少に耐性があります。 これらの結果は、Ano1 が破骨細胞に機械的刺激に応答する能力を与える内因性因子であることを示しています。 Ano1 特異的阻害剤は、骨量減少に対抗するための有望なアプローチです。

Ano1 flox マウス (Ano1fl/fl、Min-Sheng Zhu 博士からの寛大な寄贈)44 を Ctsk-Cre 系統 (鄒偉國博士からの寛大な寄贈)45 と交配して、Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスを作製しました。 。 分析したすべてのマウスは、C57BL/6 バックグラウンドで維持されました。 動物は、中国宇宙飛行士研究訓練センターの動物研究棟内で特定病原体フリー（SPF）条件下で飼育および維持されました（12時間の明期、12時間の暗期サイクル、温度は21±2℃に制御され、餌や餌は自由に摂取できます）。水）。 すべての実験手順は、中国宇宙飛行士研究訓練センターの動物倫理および実験安全委員会によって承認されました（参照番号：ACC-IACUC-2022-002）。

マウス骨髄由来マクロファージ (BMM) は、6 ～ 8 週齢の雄マウスの脛骨および大腿骨から得られました。 骨髄細胞を完全α-最小必須培地（α-MEM、10％ウシ胎児血清[FBS]、およびペニシリン/ストレプトマイシン）で洗い流し、収集しました。 細胞を、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF; 10 ng/ml、R&D Systems）の存在下、完全α-MEM培地で1日間培養した。 懸濁細胞を収集し、スライドガラスまたは培養フラッシュ上に播種しました。 細胞を、３０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍｌの核因子ｋＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む誘導培地完全培地中で培養した。 培地は２日ごとに交換した。

TRAP染色は、製造業者の指示に従って酸性ホスファターゼキットを使用して実施した(Sigma-Aldrich、カタログ番号387)。 一定期間培養した細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、４％ホルムアルデヒドで室温で５分間固定し、ＰＢＳで十分に洗浄した。 細胞をTRAP染色溶液中で37℃で0.5〜1時間、光から保護してインキュベートした。 TRAP溶液を除去した後、プレートを蒸留水で3回洗浄した。 ３つ以上の核を含むＴＲＡＰ陽性多核細胞を倒立顕微鏡（ニコン）下で計数した。

マウスの脛骨の皮を剥ぎ、4% パラホルムアルデヒドで 48 時間固定しました。 脛骨は 10% EDTA で 10 ～ 15 日間脱灰され、その後脱水され、パラフィンで包埋されました。 回転ミクロトームで 5 ～ 7 μm の切片を調製しました。 切片を脱脂し、TRAP 染色溶液とともに 37 °C で 1 時間、光から保護してインキュベートしました。 対比染色にはメチルグリーンを使用しました。 画像は顕微鏡で取得され、統計分析は BioquantOsteo Analysis System で実行されました。

メーカーの指示に従って TRIzol 試薬を使用して細胞または組織から全 RNA を抽出しました。 逆転写は、反応あたり総量 10 μl 中の 0.5 μg のトータル RNA を使用して実行されました。 メーカーの指示に従って、PrimeScript RT 試薬キット (Takara、RR037A) を使用して、RNA を cDNA に逆転写しました。 TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Takara、RR820A) を使用した定量的リアルタイム PCR (QRT-PCR)。 Gapdh を mRNA の正規化コントロールとして使用しました。 すべてのプライマーは BGI (北京、中国) によって製造されました。 以下のプライマーを使用した:Gapdh F: ACATCATCCCTGCATCCACTG、R: TCATTGAGAGCA ATGCCAGC; NFATc1 F: ACGCTACAGCTGTTCATTGG、R: CTTTGGTGTTGGACAGGATG; Acp5 F: GCGACCATTGTTAGCCACATACG、R: CGTTGATGTCGCACAGAGGGAT; Mmp9 F: GCTGACTACGATAAGGACGGCA、R: GCGGCCCTCAAAGATGAACGG; Ctsk F: GCGTTGTTCTTATTCCGAGC、R: CAGCAGAGGTGTGTACTATG; Ano1 F: CCCGTGCCAGTCACCTTTTTT、R: TCATCTGCTTCCGTTTCCAGT。

細胞を氷上の溶解緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ホスファターゼ阻害剤カクテルおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で１５分間溶解した。 骨組織を液体窒素中で乳鉢で粉砕し、溶解バッファー中で 4 °C で 30 分間溶解しました。 12,000 × g、4 ℃で 10 分間遠心分離してタンパク質画分を収集し、その後 10 mg の溶解物を SDS-PAGE に供し、ニトロセルロースフィルター膜 (NC) 膜に転写しました。 膜を5%スキムミルクでブロックし、特異的抗体とともに一晩インキュベートしました。 使用した抗体は次のとおりです。ウサギ抗 NFATc1 (1:1000、abclonal、A1539)、ウサギ抗 Ano1 (1:1000、abclonal、A10498)、ウサギ抗 p-CaMKIV 抗体 (1:1000、ImmunoWay、YP0043) )、ウサギ抗 CaMKIV 抗体 (1:1000、Cell Signaling Technology、4032)、ウサギ抗 Creb 抗体 (1:1000、Cell Signaling Technology、9197)、ウサギ抗 p-Creb 抗体 (1:1000、Cell Signaling) Technology、9198）、ウサギ抗Gapdh抗体（1：5000、Abways、AB0036）。

流体の流れは、閉じたフロー ループを使用して平行プレート フロー チャンバー内のセルに適用されました。 破骨細胞を 22 × 26 mm のカバーガラス上に 4 × 106 細胞の密度で播種し、RANKL および M-CSF を含む α-MEM 培地で 3 日間培養しました。 カバーガラスを平行平板フローチャンバーに置き、12 dyn/cm2 FSS で 30 分/日処理しました。実験中、装置は 37 °C に維持しました。 FSS と流量の相関関係は、次の方程式を使用して計算されました: τ = 6μQ/bh2、ここで、Q は流量 (cm3/s)、μ は流動媒体の粘度 (0.01 ダイン/cm2)、h は高さチャネルのτ（0.05 cm）、b はスリット幅（2.5 cm）、τ は壁せん断応力（dyne/cm2）です。 平行平板フロー チャンバーについては以前に説明しました 8,46。

超重力遠心分離機を使用して、破骨細胞に対する超重力の影響を検出しました。 この研究では、破骨細胞を 12.5 cm2 細胞培養フラスコに 107 細胞の密度で播種し、RANKL (50 ng/ml) および M-CSF (30 ng/ml) を含む α-MEM 培地で 3 日間培養しました。 気泡の存在を防ぐために、フラスコを培地で満たした。 フラスコを超重力遠心分離機の回転パネルに注意深く固定し、37 °C の過重力条件で 4 g の一定速度で回転させました。対照として、細胞を同様の方法で培養しましたが、クリノ回転を行わなかった (1 g)。 超重力遠心分離機については以前に説明しました 32。

微小重力をシミュレートするために 2D クリノスタットを使用しました。 2D クリノスタットは、中国宇宙飛行士研究訓練センター (中国、北京) によって設計され、提供されました。 回転により、細胞が認識できない重力ベクトルが生じます。 したがって、この装置は細胞が重力を感じるのを防ぎます。 破骨細胞の処理方法は、回転シミュレーションによる微小重力の説明に続きました。 フラスコをクリノスタット システムの回転パネルに注意深く固定し、30 rpm/分の一定速度で回転させて微小重力 (0.01 g) をシミュレートしました。 対照として、細胞を同様の方法で培養しましたが、傾斜回転を行わなかった(1 g)。 2D クリノスタットは以前に説明されています8,32。

破骨細胞を5 mM MQAE (Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.、中国)とともに30分間インキュベートし、その後PBSで5回洗浄した。 細胞蛍光画像は、共焦点レーザー走査型顕微鏡 (CLSM、Leica SP5、ドイツ) を使用し、励起光 350 nm および放射光 460 nm で実行されました。 [Cl-]i の変化は蛍光強度の変化として表されました。 各細胞の平均蛍光強度をImage Jソフトウェアで分析した。

後肢の荷降ろし手順は、尾部の懸垂によって達成されました。 すべての雄マウスを標準的な動物飼育条件下で維持した。 生後３ヶ月のAno1fl/flおよびCtsk-Cre;Ano1fl/fl雄マウスを個別にケージに入れ、滑車から吊り下げたチェーンに取り付けた粘着性サージカルテープのストリップを使用して尾で吊り下げた。 マウスを床に対して 30 度の角度で吊り下げ、前肢のみを床に触れさせました。これにより、マウスは移動し、餌と水に自由にアクセスできるようになりました。 マウスに尾を懸垂して後肢の除荷を 28 日間行った。 安楽死の 10 日前と 2 日前にカルセイン (30 mg/kg、シグマ) をマウスの腹腔内に注射して、新骨形成を標識しました。 安楽死後、血清と全骨組織を収集しました。 すべての実験手順は、中国宇宙飛行士研究訓練センターの動物倫理および実験安全委員会によって承認されました。

プロトコール 30 に従って、Electroforce BOSE 5100 を使用して、生後 16 週齢の雌 Ctsk-Cre;Ano1fl/fl マウスおよび Ano1fl/fl マウスの左脛骨に、軸中央に +1200 με ピークひずみを負荷しました。マウスに 2 週間（1 ～ 5 日目および 8 ～ 12 日目）連続 5 日間負荷を与え、負荷は 4 Hz の三角波形で 1200 サイクル、各サイクル間に 0.1 秒の休止時間を設けて適用されました。 安楽死後、15 日目に骨組織を収集しました。

マウスの大腿骨の皮を剥ぎ、75% エタノールで固定しました。 大腿骨遠位部および脛骨近位部については、各マウスからの大腿骨遠位部および脛骨近位部の二次海綿体全体を、microCT システム (mCT40、SCANCO MEDICAL、スイス) を使用して ex vivo でスキャンしました。 簡単に説明すると、組織体積あたりの骨体積（BV/TV）、小柱数（Tb.N）、小柱の厚さ（Tb.Th）、および小柱間隔（Tb.スプ）。

分析は、マウスＣＴＸ１ ＥＬＩＳＡキット（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｄ７２１２０４）を用いて、ＣＴＸ－１の血清濃度についての製造業者の指示に従って実施した。 このアッセイは、サンドイッチ酵素イムノアッセイ技術を採用しています。 抗マウス CTX1 抗体でプレコートされたマイクロプレートに標準およびサンプルを加えます。 インキュベーション後、ビオチン結合抗マウス CTX1 抗体を添加します。 次に、HRP結合ストレプトアビジンと結合して免疫複合体を形成し、その後インキュベートおよび洗浄して未結合の酵素を除去し、発色基質TMBに添加して青色を生成し、酸の作用により最終的に黄色に変換されます。 最後に、吸光度 (OD) 値を 450 nm で測定しました。 サンプル中のマウス CTX1 の濃度は OD 値に比例しました。 サンプル中のマウス CTX1 の濃度は、標準曲線を描くことによって計算できます。

細胞ベースの実験は、少なくとも 3 回の独立した反復で実行されました。 動物をランダムに異なるグループに分け、各グループに少なくとも 5 匹のマウスを使用しました。 データは平均値±標準誤差として表示されます。2 つのグループ比較の統計的評価にはスチューデントの t 検定を使用しました。 3 つ以上のグループを使用した統計分析は、一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して実行されました。 すべての統計分析は、Prism ソフトウェア (Windows 用の Graphpad prism、バージョン 8.0) を使用して実行されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001 で差が有意であるとみなされました。

この研究中に生成または分析されたデータは、本文（図1〜8）および補足図（補足図1〜4）に示されています。 元のゲルとブロットの画像を補足図に示します。 5～8。 グラフと画像のソース データは、補足 Excel ファイル (補足データ) にあります。 合理的な要求に応じて、すべてのリソースも著者から入手できます。

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ANO1 フロックスマウスを提供してくださった Min-Sheng Zhu (中国、南京の南京大学)、Ctsk-Cre マウスを提供してくださった Weiguo Zou (中国科学院、中国上海、上海生化学・細胞生物学研究所) に感謝します。 この研究は、中国国家自然科学財団 (Yingxian L. への 81830061、82192882、Yuheng L. への 82072108、および JL への 32000879)、中国有人宇宙計画の宇宙医学実験プロジェクト (HYZHXM01006) から YingxianL への支援を受けました。

北京工業大学、北京、中国、生物医学および医薬品の分離および分析のための北京重点実験室

孫偉佳＆戴栄基

国家重点宇宙医学基礎研究所、中国宇宙飛行士研究訓練センター、北京、中国

Weijia Sun、Yuheng Li、Jianwei Li、Yingjun Tan、Xinxin Yuan、Guohui Zhong、XiaoYan Jin、Zizhong Liu、Ruikai Du、Wenjuan Xing、Dingsheng Zhao、Jinping Song、Youyou Li、Junjie Pan、Yunzhang Zhao、Qi Li、Yingxian Li

中国人民解放軍総合病院整形外科研究所、北京、中国

Haoye Meng、Jianting Ye、Aiyuan Wang

Ojiang Laboratory (再生医療、視覚、脳の健康のための浙江研究所)、温州、浙江省、中国

シュクアン・リン

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WS は実験の大部分を設計および実行し、データを分析し、原稿を準備しました。 Yuheng L. はμCT 解析に貢献しました。 JL は動物実験を計画しました。 YT は、クリノスタット、超重力遠心分離機、流体せん断応力施設に貢献しました。 HM、JY、AW は機械的負荷装置と分析システムを提供し、GZ、XY、XJ は生体内治療を支援しました。 DZ、ZL、RDWX、JS は原稿作成に関する提案を提供し、Youyou L.、JP、YZ、QL は実験資料のサポートを提供しました。 SL、RD、および Yingxian L. が研究を指揮し、論文を改訂しました。

Shukuan Ling、Rongji Dai、Yingxian Li への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Zhousheng Xiao と他の匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: Martina Rauner および Christina Karlsson Rosenthal。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Sun、W.、Li、Y.、Li、J. 他機械的刺激は、Ca2+ 活性化 Cl- チャネル Anoctamin 1 の制御を通じて破骨細胞機能を制御します。Commun Biol 6, 407 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04806-1

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受信日: 2022 年 8 月 24 日

受理日: 2023 年 4 月 4 日

公開日: 2023 年 4 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04806-1

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