動的な病原体検出と社会的フィードバックがアリの集団衛生を形作る

Dec 11, 2023

Nature Communications volume 14、記事番号: 3232 (2023) この記事を引用

341 アクセス

45 オルトメトリック

メトリクスの詳細

協力的な疾病防御はグループレベルの集団行動として現れますが、グループのメンバーが基礎となる個人の決定をどのように行うかはほとんど理解されていません。 実験モデルとして庭のアリと真菌病原体を使用して、個々のアリのグルーミングの選択を決定する規則を導き出し、それらがコロニーレベルの衛生状態をどのように生成するかを示します。 時間分解行動分析、病原体の定量化、および確率的モデリングにより、アリは病原体負荷が高いと感知すると毛づくろいを増やし、感染力の高い個体を優先的に狙うが、巣の仲間によって毛づくろいを受けた後は一時的に毛づくろいを抑制することが明らかになった。 したがって、アリは、他人の感染力と、アリ自身の感染力に関して受け取る社会的フィードバックの両方に反応します。 これらの行動ルールはアリの瞬間的な判断からのみ推測されますが、1 時間にわたる実験のダイナミクスを定量的に予測し、相乗的に組み合わせてコロニー全体の効率的な病原体除去を実現します。 私たちの分析は、病原体の脅威と社会的フィードバックに関するローカルで不完全だが動的に更新される情報のみに基づいた騒々しい個人の決定が、強力な集団的な疾病防御につながる可能性があることを示しています。

多くの場合、集団行動は単独行動よりも成功します。 これは、局所的、ノイズの多い、または不完全な情報に基づく単純な個人の決定が、相互作用する遺伝子 1、ニューロン 2,3、組織内の細胞 4、単細胞生物 5 などのシステムにおいて、フィードバックを通じて相互作用し、複雑で効率的な集団行動を生み出す可能性があるためです。または動物集団6、7、8、9、10、11。 社会性をもつミツバチやスズメバチ、アリやシロアリなどの社会性昆虫は、コロニーレベルでのパフォーマンスに選択が作用するもので、自己組織化された集団行動の出現の典型的な例です12。 彼らのコロニーは集団輸送、食料収集、巣の選択と建築をマスターしています13、14、15、16、17、18、19。 さらに、社会性昆虫は協力して病気を防御し、コロニーレベルの防御、つまり社会的免疫を生み出します20。 社会性昆虫は、社会的相互作用ネットワークを調節することで病気の伝播を減らすだけでなく 21,22、暴露されたコロニーメンバーから感染性粒子を取り除くなどの積極的な衛生管理行動によって全体的な病気のリスクも減らします 23,24,25,26。 社会性昆虫の衛生的なレパートリーについてはこれまでに説明されているが 20、27、28、29、30、31、これらの行動の根底にある定量的な決定規則と、それらがコロニー全体の病気の防御にどのように組み合わされるかは、ほとんど解明されていないままである。

緊急の集団衛生の基礎を形成する個々の意思決定プロセスを理解するために、ここでアリを実験的状況に置き、異なる感染性真菌病原体を運ぶ2つのグループメンバー間で衛生管理をどのように分配するかを選択できるようにした。 すべての個別および相互のグルーミング イベントを時間分解で観察し、実験終了後の各アリの胞子量を定量化することで、実験中のすべての時間枠で、処理された両方のアリの胞子量を推測することができました。 この情報に基づいて、実行されたグルーミングイベントごとに、グルーミングされたアリがより高い電流胞子負荷を持つアリであるか、より低い電流胞子負荷を持つアリであるかを判断することができました。これにより、アリはより高い電流で個体を過剰にグルーミングしますが、必ずしも初期値が高いわけではないことが明らかになりました。 – 胞子負荷。 私たちは確率モデリング 32 によって実験研究を補完し、個々の毛づくろいの決定を決定するアリの最近の経験における普遍的な決定ルールと要因を推測しました。 この共同アプローチは、アリの毛づくろい活動が、コロニーのメンバーから現れる病原体の脅威の認識に依存するだけでなく、コロニーのメンバーが自らの感染力について提供する社会的合図に対するアリの感受性にも依存することを示している。 特に、個々のアリは、最近他のアリに胞子を多く認識したほど、他のアリの毛づくろいを多くしますが、自分自身で毛づくろいをした後は、あまり毛づくろいをしません。 毛づくろいの頻度はアリ自身の胞子量によって決まるため、この抑制効果は最も高い胞子量を持つ個体で最も強くなり、社会的フィードバックによって最も感染力の高いコロニーのメンバーが世話をするのを効果的に防ぐことができる。 さらにモデル化により、観察された個々のアリの毛づくろいの決定は、コロニーのメンバーと連続して遭遇する間に誰を毛づくろいするかという胞子の量に依存する、しかし確率論的な規則によって最もよく説明できることが明らかになった。 このような単純なローカルルールは、すべてのコロニーメンバーの胞子量に関するグローバルな知識を必要としないため、大規模なコロニーでも効率的な病原体除去が可能になる可能性があります。 さらに、アリが自由に毛づくろいの意思決定をすることを妨げると、グループレベルの病原体の除去効率が低下するという実験的証拠を示し、コロニーレベルの衛生状態については十分な情報に基づいた個体の選択が重要であることを明らかにしました。 総合すると、これは、脅威レベルと社会的フィードバックの両方を統合した単純な個別のルールにより、最も感染力の高いコロニーのメンバーが最も多くの医療を受けるが、介護にはほとんど関与せず、コロニーレベルでの非常に効率的な社会的免疫 20 と病気蔓延のリスクの低減 33 につながることを示しています。

アリの衛生管理に関する個別の決定ルールを導き出すために、個体レベルとグループレベルの病原体負荷のさまざまな実験の組み合わせを設定し、個々のグループメンバーの行動を1/15秒の時間分解能で包括的に観察し、病原体の除去と伝達を定量化しました。 。 女王アリは社会的免疫手段を講じないため、研究を働きアリに限定しました34,35。 アリの集団現象はすでに 6 匹の小グループで発生しているため 36、我々はアリ Lasiusgnogregus の働きアリ 6 匹からなるグループ (n = 99) を形成し、すべての個別およびつがいの衛生行動を観察しました。 私たちは、作業員のうち 2 人を高用量 (F) または低用量 (f) の真菌病原体 Metarhizium robertsii、または非病原性対照 (C) で治療し、それらを組み合わせて全体の病原体量と総量の両方が異なるグループを作成しました。治療を受けた 2 人の個人間の負荷の違い。 したがって、未処理の4匹の巣の仲間は、処理された2匹の個体間で明らかな（FC、fC）、それほど明確ではない（Ff）、または初期胞子量の差がない（FF、ff、CC）のいずれかに直面しました（図1a;補足表1; n = 16） -1グループの治療につき17回の反復）。 個々のアリは、体に適用された独自のカラーコードによって区別でき（ただし、色は観察者にアリの治療を明らかにしない）、病原体で処理されたアリの胞子は、遺伝的にコード化された別個のラベル（蛍光GFP対RFP;補足）によって区別できます。図1）。 我々は、各アリの衛生行動、特に自己衛生（セルフグルーミング）と他者のグルーミング（アロググルーミング）を処理前30分間と処理後90分間継続的に定量化した。 グルーミングは社会性昆虫の一般的な衛生行動であり、昆虫の口部分による体表からの感染性粒子の除去、その後の頭部の特定の頬下ポケットでの圧縮と消毒、その後の不活化病原体のペレットとしての排出を組み合わせたものである23,24。 37. 実験終了後、各アリをサンプリングし、高感度定量的PCR（アリの遺伝子配列を標的としたドロップレットデジタルPCR）を用いて、アリの頭と体、およびグループごとに生産されたペレットの胞子の数と起源を決定しました。ラベル; n = 594 アリと 77 ペレットプール)。 これにより、病原体の除去に成功したもの（アリの頬下ポケットに集められた胞子、またはペレットとして排出されたもの）、除去されなかった感染性胞子（胞子処理個体の体に残ったもの）、および相互汚染を示す伝染した胞子（見つかったもの）を区別することができました。他のアリの体で;補足図1)、これは治療後90分間に起こりました。

a 6 つの処理グループの実験設定。各グループは、4 匹の未処理アリ (巣メイト) と、さまざまな病原体負荷 (赤色 F、高、黄色 F、低、灰色 C、対照) で処理された 2 匹のアリで構成されます。 F 処理アリおよび F 処理アリに適用された曝露負荷に基づくグループの胞子負荷 (それぞれ n = 30 個体について曝露直後に決定) および 2 つの処理アリ間の初期胞子負荷の差が処理グループごとに示されています (中央値が示されています。四分位範囲については「方法」セクション)。 治療によって引き起こされる行動の変化。治療されたアリについて、b の体（それぞれ頭、補足表 2）の自己グルーミング、c の自己グルーミング、および d の自己グルーミングに費やした有効時間の割合における、治療前期間（ゼロライン）との差として報告されます。と未処理の巣の仲間 (青色 N)。 平均±標準誤差は不透明な色で表され、色合いは95％CIを示します、n = 594アリ、99反復、補足表1）。 ***p ≤ 0.001 (詳細は補足表 2 に示されています)、*p = 0.023、ns p = 0.105 で示される、治療後と治療前のペアのウィルコクソン検定の複数検定用に調整された両側 p 値。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

病原体で処理されたアリは、自己毛づくろい活動を強化し 24,33 (図 1b、補足表 2)、また、胞子の消毒を助ける抗菌毒である自己生成ギ酸の経口摂取 (補足図 2、補足表 2) を強化しました。頬下ポケット37。 病原体の適用だけでなく、あらゆる種類の処理（F、f、C）は、個体が他の人を毛づくろいする傾向を減少させ、アリにとって処理自体が妨害として経験されたことを示唆しています（図1c、補足表2）。 したがって、治療を受けたアリは、受け取った胞子負荷に応じて自己毛づくろいを行ったが、同様に、治療を受けることで経験した全体的な混乱の結果として、他のアリの毛づくろいを控えた。 一方、巣の仲間は高レベルの衛生的世話を提供し、主に病原体で治療された個体に向けられ、頻度は低いが対照で治療された個体にも向けられた。 これは、アリやシロアリなどの他の社会性昆虫の衛生管理は、菌膜化合物エルゴステロールなど、暴露された個体で検出される化学的病原体の合図によって引き起こされるという観察と一致しています38,39。

未治療の巣の仲間は、グループの病原体曝露への反応としてセルフグルーミングも増加しました（図1b、補足表2）。 特に、胞子を積んだ個体（F、f）をグルーミングした後は、未処理の巣仲間（N）をグルーミングした後よりも自分自身をグルーミングするのに多くの時間を費やしましたが、対照で処理されたアリをグルーミングすると状況依存の反応が誘発されました（補足図3a）。 。 注目すべきことに、巣仲間の自己グルーミングは、感染性アリに対してグルーミングを行うことによってのみ誘発され（補足図3b）、感染性アリからグルーミングを受けることによっては誘発されず、したがって接触に対する単純な反応ではありませんでした。 消毒毒の使用量の増加を示した治療を受けた個体とは対照的に、巣の仲間は製造コストがかかる毒の使用量を減少させた 40 (補足図 2、補足表 2)。 治療を受けた個体による揮発性ギ酸を豊富に含む消毒剤の使用量が増加していることを感知して、巣の仲間が自分の毒の使用を控えるかどうか、あるいは、病気の原因となる高濃度の病原体による相互汚染のリスクが低いことを評価できるかどうかは、まだ不明である。レベル41。 根底にあるメカニズムとは独立して、感染者の巣の仲間によるこのような自己衛生の向上は、コロニーの病気のリスクを軽減するため、疫学モデルによって進化すると予測されています33。

個人および集団の衛生行動により、最初に適用された胞子負荷から曝露された個人の胞子が 80% 以上減少しました。 実験終了時には巣の仲間の 85% が胞子に汚染されていましたが、その病原体レベルは非常に低く (図 2a、「方法」を参照)、病気を引き起こすことはめったにありませんが、防御免疫を引き起こす可能性があります 41。 実験終了時に各アリの頬下ポケットから回収された胞子の数と種類（蛍光特異的ddPCRで定量）は、実験の最後の60分間（曝露後30～90分後）のアリの毛づくろい活動とよく相関していた。 。 ただし、以前のグルーミングイベント（分1〜30）は、おそらくアリがその間にすでにこれらの胞子をペレットとして排出していたため、保存された胞子にはあまり反映されていませんでした（図2a、補足図4）。 最初に全体的により高い胞子負荷を受けた実験グループは、より多くの数のペレットを生成しましたが、各ペレットに詰め込まれた胞子の数は処理とは無関係でした（補足図5a）。 これは、アリが頬下のポケットが特定の充填状態に達するまで毛づくろいをし、その後ペレットの排出を引き起こすことを示唆しています。 重要なことに、ペレットが排出されるまでに必要な有効グルーミング時間は実験の過程で増加し、グループ内の胞子量が減少するにつれて胞子除去効率が低下したことを意味しています（補足図5b）。 この観察は、グルーミング効率に関するタイプ II 機能応答モデル 42 によって定量的に捉えられました (ミカエリス・メンテン反応速度論と数学的に同等、補足表 3、方法)。このモデルでは、グルーミング中の胞子除去速度は、病原体が細胞に負荷されると飽和します。アリの感染力は高いが、病原体量が少なくなると減少する。 このモデルを胞子データに当てはめることで、残っている胞子負荷とアリが受けたグルーミングから逆計算することで、実験中いつでも、胞子処理された各アリの現在の負荷を推測することができました（図2b）。

各アリの体に残っている、または透過によって取得された（不透明）、およびアリの頭部への収集または廃棄されたペレットとして除去された（半透明色）、測定された最終胞子量のFf処理グループの例。 赤は元々 F 個体に適用された胞子を示し、黄色は F 個体に適用されました。 b パネル a の病原体処理された 2 匹のアリの推定胞子負荷動態。 水平線は、F および f 個体の逆計算された初期負荷を示します。 矢印は、例示的な現在の胞子負荷差を示す。 c すべての巣仲間の同種グルーミングイベント全体にわたって集められた、グルーミングされた個体にかかる胞子負荷の割合（両方の胞子処理アリの総胞子のうち）の分布（灰色の棒）を、確率（黒線）と比較すると、アリの好みが明らかになります。より高い負荷のアリをグルーミングする場合（ブートストラップされたコルモゴロフ・スミルノフ検定、D = 0.053、両側 p = 1.632e−6（≤0.001 として *** で表示）、緑色の線は平滑化された観察値と偶然の期待値の差を示します。補足図6も参照してください)。 d 個々の同種グルーミングイベントの持続時間（持続時間が 2 分未満のグルーミングイベント [イベントの 90%] が示されている）は、系統的に現在の負荷の割合に依存しない（42/45 ペアごとのクラスカル・ウォリス検定は、複数の検定に対して両側で調整されている p > 0.05） ); c、dは、49個のFF、Ff、ffの複製からのn = 196 Nに基づいています。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

巣の仲間が胞子処理された 2 個体のどちらかを毛づくろいすることを選択したすべての決定 (49 FF、Ff、ff 処理グループにおける 196 N の n = 5001 の決定) について、この時間分解推定胞子量情報を使用して、巣の仲間が現在負荷の高い個体 (以下、負荷の高い個体) をターゲットにしたかどうか。 驚くべきことに、L.ネグレクトアスアリは、他のアリにかかる瞬間的な胞子負荷を推定し、グルーミングが最も効果的であるより負荷の高い個体に向かってグルーミングを偏らせることにより、情報に基づいたグルーミングの選択を行うことができるようであることを我々は発見した。 詳細には、アリは負荷の高い個体をより頻繁にターゲットにしましたが（図2c、補足図6も参照）、グルーミングイベントごとの期間は変更していませんでした（図2d）。 注目すべきことに、より高い負荷の個体に対するこのグルーミングバイアスは、アリの電流に依存していましたが、最初に適用された胞子負荷には依存していませんでした。これは、より高い初期胞子負荷を持つ個体が実験の初期段階でのみ優先的にターゲットにされたためです（補足図7）。初期荷重は依然として現在の荷重に近似しています (図 2b)。 したがって、アリはグルーミングを選択する際に、常に更新される病原体負荷情報に反応していることになります。

次に、これらの統計的観察を、個々のアリの瞬間ごとの決定と、出現するコロニーレベルのダイナミクスを数学的に予測できる、一貫した十分な行動規則のセットに変換することを目指しました。 我々は、個々のアリが自己グルーミング、同種グルーミング、または衛生的行動を行わないという離散的な行動状態を確率的に切り替えるモデルのクラスを開発しました32（補足注1、図3a）。 交差検証されたモデルの選択により、アリが次の瞬間に毛づくろいをするかどうかを選択するために統合する要因が特定されました（補足注1）。 私たちのモデルは、過去 ~ 分 (L) 以内にアリが他のアリに遭遇した胞子量と、過去 ~10 秒以内に他のアリから受けたグルーミングに関する組み合わせ情報に基づいて予測したときに、観察されたグルーミング活動を最もよく回復しました。 (R、図3b)。 R 因子と L 因子を使用した結合モデルは、L のみのモデルと比較して、図 3b に示す全体的な予測誤差をわずかに改善しましたが、次のアリの行動の選択における瞬間ごとの予測可能性は大幅に改善されました。 (補足1)。 観察されたアリの行動を再現するために、私たちのモデルには、（感染性レベルとは無関係に）何らかの治療を受けたときのアリの行動の変化を記述する個々の撹乱因子（ρ、図3c）をさらに含める必要がありました。

a アリはどの瞬間にも、非活動状態 (IDLE 状態)、自己毛づくろい (SELF)、または別のアリの毛づくろい (ALLO) を行っています。 状態間の確率的遷移 (矢印) は、特定されるさまざまな要因に依存します。 (b) モデル選択により、5 つの独立した反復シミュレーション セットでの予測誤差を最小限に抑えることにより、アリが最近経験した同種グルーミングの実行 (P) と受信 (R)、胞子負荷 (L) などの予測要因が特定されました。すべてのアリのクラス (F、f、C、N) および治療の組み合わせにわたる時間分解活動。 最良のモデル (緑) は係数 R と L を使用し、c はすべての処理されたアリ (F、f、C) が未処理のアリと比較して同種グルーミングを均等に抑制する個別の撹乱係数 (ρ) と、次の逐次選択ルールを使用します。胞子負荷情報 (ルール 5、緑色のバー) を動的に更新して、グルーミングの対象を選択します。 このルールは、代替ルール (ルール 1 ～ 4、すべてのルールは右側に図式化されています。詳細については補足ノート 1 を参照) よりもモデル選択 (左側のバー) によって優先されます。 代替ルール 1 では、アリは毛づくろいの対象を一様にランダムに選択します。 代替ルール 2 は、動的に対応するルール (緑色のバー) と同じパラメータを持つ逐次選択ルールの変形ですが、負荷は動的に更新される現在の負荷ではなく初期負荷になります。 代替ルール 3 では、処理に応じて各アリを選択するための静的確率を使用します。 確率はデータに最もよく適合するように最適化されています。 代替ルール 4 は、各アリが現在の最大負荷でアリを決定論的にグルーミングするためにグローバルな現在の負荷情報にアクセスできることを前提としています (円の暗さは胞子負荷強度を反映しています)。 bd では、バーは一定速度モデル (水平破線) と比較した、5 つの個別のシミュレーションの平均を表します (それぞれ円で示され、誤差バーは±std を示します)。 e 特定された最良のモデルの回路図。 アリは、最近他のアリに高い胞子負荷を感じたときに同種グルーミングを増幅させ、グルーミングを受けた後はそれを抑制します。 同種グルーミングへの移行は、処理されたすべてのアリでさらに抑制されます (ρ)。

最後に、私たちの分析により、より負荷の高い個体をグルーミングするアリの好み（図2c）は、いわゆる逐次選択ルールによって最も簡潔に説明されることが明らかになりました。つまり、アリはグループのメンバーを次々と調査し、次のことにコミットします。現在プローブされているアリをグルーミングする確率は、プローブされているアリの現在の胞子量に応じて増加します（図3d、補足注1）。 注目すべきことに、この選択ルールでは、アリが他の複数のアリの胞子量を比較する (そして記憶する) 必要がありません。 経験的に特定されたルールは、その局所的かつ逐次的な性質の結果として、総胞子除去効率の観点からは最適ではない可能性がありますが、それでも、負荷の高い個体を優先的に選択するという体系的なバイアスにつながります。 アリの巣の選択など、個別の比較 (したがって全体的な知識) を必要としない同様の集団的選択が他の状況でも報告されています 14,18,43。 逐次選択ルールを使用したシミュレーションは、さまざまな代替案よりもデータとよく一致しました (図 3d)。 私たちが検討した最も単純な代替案は、アリが毛づくろいの対象を一様にランダムに選択するというものでした。 ただし、この代替案ではデータとの一致が最悪でした。 次に、動的に更新されない情報に基づいてアリが毛づくろいの対象を選択する、それほど簡単ではない 2 つの代替案を検討しました。 最初の更新を行わない代替案では、アリは順次選択を実行しましたが、初期胞子ロードのみを使用しました。 動的負荷更新を削除すると、データへの適合性が大幅に悪化しました。 2 番目の更新を行わない代替案では、アリは固定 (ただし不均一) 確率を使用して、F、f、C、N ターゲットの中から選択します。 これらの確率自体がデータとの一致を最大化するように適合された場合でも、この代替案は依然として逐次選択のパフォーマンスを下回っています。 私たちが検討した最後の代替案では、動的な更新が可能であり、アリがすべての現在の負荷に関する完全な情報を取得して、最も高い現在の負荷を持つアリを決定的に選んでグルーミングできると仮定しました (最大ルール)。 このような仮説的なルールは、コロニーから最も迅速に胞子を除去する結果になりますが、これもデータによって裏付けられていませんでした。

グルーミング選択に関するさまざまなルールの予測パフォーマンス（図3d）は、継続的な情報更新の重要性を明確に特定し、そのような情報を個々のアリが利用できる生物学的に妥当な手順として逐次選択を示唆しました。 逐次的な選択は、明確な実験的特徴、つまり同種グルーミングに先行するがすぐには起こらない複数の一時的なアリ-アリ相互作用の存在を予測します。 したがって、2つの実験反復でアリの行動を詳細に分析し（補足図8）、アリがより負荷の高いアリを優先的に毛づくろいする前にターゲットを順番に探索できるかどうかを確認しました。 実際、ほとんどの同類グルーミングイベントに先立って、アリに共通の認識および識別行動である触角の発作が見られました44。これにより、アリは最終的にグルーミングするアリを選択する前に、異なる標的個体と数回の一時的な接触を行います。 通常、選ばれたアリは毛づくろいの直前にもアンテナを張られていました。 私たちの実験では、逐次選択を支える精査メカニズムとして触角を明確かつ因果的に特定することはできませんが、この考えを支持するメカニズムの基礎と相関関係の証拠を提供します。

まとめると（図3e）、アリは、（i）他のアリへの病原体負荷を最近認識した場合、つまり進行中のコロニーレベルの感染を示している場合、アリログルーマーになる可能性が高くなります。 (ii) 最近、他人によるグルーミングを受けていない – これは、それ自体の伝染性がそれほど高くない可能性が高いことを示しています。 (iii) 実験中にいかなる種類の妨害(例えば、治療)も受けなかった。 さらに、アリがアログルーマーになると、(iv) より負荷の高いアリを優先的にターゲットにします。 私たちは、アリの瞬間ごとの決定に関するデータを使用して、モデルパラメータの最尤推定（補足注1）によってアリがどのように情報（i-iv）を組み合わせるかを特定しました。 結果として得られたモデルシミュレーションは、1時間の実験全体にわたって、グループレベルと個人レベルの両方で、すべての処理と反復にわたる衛生挙動と胞子の除去を正確に捕捉しました（図4、補足注2）。 瞬間的な個々の決定から長期的なダイナミクスを正しく予測することは、モデルの重要なテストを構成し 45 、活性物質の統計物理学における長期スケールでの集団ダイナミクスの分析と並行します 46。

個々のアリについて集計および例示された、実験データ (左) と確率的シミュレーション (右) の並べて表示。 a 平均アクティビティ トレースは 30 秒のウィンドウに分割されます。 円は平均値を示し、陰影を付けた領域は平均値を中心とした標準誤差を示します。プロット内で見やすくするために、処理済みの [F、n = 66、赤。 f、n = 65、黄色。 C、n = 67、灰色] および 99 反復の巣の仲間 [N、n = 396、青色] アリの 3x)、グルーミング タイプ (自己グルーミング、同種グルーミングの実行および受信) およびアリの処理ごとに分けられ、事前とアリの処理が示されています。後処理。 b 各アリの詳細な活動ラスター (Ff の例では、各ラスター内の行として F、f、および 4N)。 (上) F- および f- の推定現在の胞子負荷は、データのグルーミングと同等の時間スケールでのシミュレーションにより減少します。 (下) 実験の 4 つの 30 分間隔のグルーミング ネットワーク (pre: 30 分間の前処理期間、ポスト 0 ～ 30、30 ～ 60、および 60 ～ 90 分の 3 つの 30 分間に分かれた後処理期間)処理後; 縁の厚さ = アリごとに受け取った同種グルーミング イベントの合計期間)。

アリの行動を最もよく捉える推測ルールは、アリが緊密な接触者から入手できる局所的な情報にのみ基づいています。 理論的には、アリが常に現在最も高い負荷で個体をグルーミングしていれば、コロニーはさらに多くの胞子を取り除くことができます（最大ルール、図3d、補足注1）。 しかし、この考察は、アリが自然のコロニー条件で形成する大規模な集団において個々のアリが直面する生物学的制約を無視しています47。 それには、各アリがそのグループのメンバーの最大病原体量を評価して記憶することによって全体的な情報を収集し、その後、最も感染力の高い個体を認知的に識別し、毛づくろいする個体を物理的に特定する必要があるだろう。 私たちは、個々のアリが病原体負荷状態に関する情報を収集するために最初に他のアリを探索するか、または遭遇した他のアリに直接アログルームして、それによって病原体負荷を減らすかのいずれかに時間を費やす別の確率的シミュレーションのセットで、さまざまな選択ルールの効率を調査しました。 他のアリの探索に時間コストがかかるとすぐに、私たちのシミュレーション (補足注 2) は、実験に動機付けられた逐次選択ルール (安価な部分情報に基づく) が、仮説の最大ルール (コストのかかる完全な情報に基づく) を上回ることを示しています。コロニーのサイズは増加します (図 5)。これは、探査と搾取のトレードオフの古典的な現れです 48,49。 ここでの探索とは、巣の仲間が、最も効率的にグルーミング (搾取) できる、胞子量が最も多いアリを見つけるための努力を指します。 これは、新しい、おそらく豊かな採餌場を探すのに費やす時間と、既知ではあるがおそらくより貧弱な採食場を開拓するのに費やす時間とのバランスをとる必要がある採食動物が直面する問題に同じトレードオフを適用することに似ています。 我々は、巣の仲間が直面する決定は、速度と精度のトレードオフの観点からも理解できることを指摘します50、51、52。 ここで、巣の仲間はより正確な選択をする（つまり、最も負荷の高い個体を見つけて最も効率的なケアを提供する）ために、より多くの時間を投資する（つまり、コロニーのメンバーを調査する）必要があります。 最も効率的な胞子除去をもたらす逐次選択ルールにおけるグルーミング確率の観察された負荷への正確な依存性はさまざまな要因に依存しますが、すべての効率的なルールはグルーミングの対象として非感染性アリをターゲットにする非常に低い確率を共有します (補足注 1) 、補足注 2)、データで観察されるように。 私たちの実験で使用したような小さなグループであっても、アリが効率性をそれほど犠牲にせずにグローバルな情報を収集し、最適な最大ルールを使用できる可能性がある場合でも（図5）、私たちのデータは優先的に逐次選択ルールをサポートしていることに注意してください。 これは、誰を毛づくろいするかについてのアリの決定が、自然のコロニーサイズにおける選択圧力の下で進化した、組み込まれた最適な戦略を反映していることを示唆しています。

アリは、対象のアリにかかる胞子の量を推定するために (探索)、遭遇ごとに時間コスト tE を発生し、それを毛づくろいする (搾取) ために tG を発生します。 推論された順次選択ルール (SEQ、部分情報) は、病原体の 90% を除去するのに必要な時間の点で、ゼロ以外の tE/tG についてコロニー サイズが大きくなるにつれて、最大ルール (MAX、完全な情報) よりも優れています。

次に、モデルの洞察の生物学的意味を調査しました。 より高い負荷の個体に対する巣の仲間のグルーミングバイアスは、処理された2個体の負荷が明らかに異なる場合により顕著ですが、2個体間の差が小さい場合にはすでに発現していることがわかりました（図6a; n = 8129のグルーミング決定）少なくとも 1 つの胞子処理個体を用いた 82 回の反復で 328 N による）。 これにより、2人の個体が最初に等しい胞子負荷を受け、その後、自己グルーミング履歴と同種グルーミング履歴の違いにより分岐した場合でも、巣の仲間はより負荷の高い個体を優先的にグルーミングすることができます（補足図9）。 このような行動は、アリが最初に加えられた負荷の長期記憶を保持するのではなく（補足図7）、アリがごく最近に知覚した胞子負荷に関する情報を使用する場合（補足注1）に必然的に現れます。 病原体負荷情報のこのような絶え間ない更新は、アリが病気のリスクの変化に動的に反応するための鍵であると思われます。

a より負荷の高いアリへの毛づくろいの偏りの証拠。 巣の仲間がより負荷の高いアリを毛づくろいするという選好は、処理された 2 匹のアリ間の現在の胞子負荷の差が飽和に向かうにつれて増加します (82 回の反復からの 328 N に基づくデータ ビン (CC を除く)、スピアマン ランク相関、黒線: 理論的期待値、黒線: 理論的期待値。補足図9も参照してください)。 両側 p 値 p = 1.515e−6 (≤0.001 として *** で示されます)。 b 社会的フィードバックの証拠。 最近グルーミングを受けたアリの同種グルーミングへの移行は抑制される（処理前: すべてのアリが黒、n = 594; 処理後: 巣の仲間が青、n = 328; 処理されたアリが茶色、n = 164; 別の F については、f、C 補足図 10 を参照）。 スピアマンランク相関によって評価された時間依存性 (rho が与えられている; 5 秒ビンにわたる平均 ± 標準偏差; 実線は指数関数的適合を示す)、両側 p 値: 巣の仲間 p < 1 e −11、治療された個体 p < 1 e − 11、前処理: p = 2.1 e−7 (≤0.001 についてはすべて *** で示されています)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

私たちのモデルは、アリが衛生管理の決定を下す際に社会的フィードバックに反応することも明らかにしました（図3b）。 社会的出会いは、採餌 53,54 や巣の避難 55 の決定など、さまざまな行動に影響を与えることが知られています。 ここで、アリが他のアリによってグルーミングされた後、自分自身の同種グルーミングのパフォーマンスを抑制することがわかりました。 この抑制効果は、グルーミングを受けた後の最初の 1 分間に最も強くなります。 その時間経過は、約 30 分のタイムスケールで指数関数的に減衰します。 アリは病原体の負荷が高いときに優先的にグルーミングを受けるため、負荷の高い個体はこの社会的フィードバックによってより強く抑制されます。 毛づくろいの抑制は、受けた毛づくろいに対する一般的な反応であり、病原性の脅威がない場合（つまり、治療前の期間）であっても、すべてのアリで発生します。 抑制効果は、処理されたアリでは病原体のない処理前状況と比較して約2倍増加しましたが、未処理の巣の仲間では約2倍減少しました（図6b）。 したがって、未治療の巣の仲間は、グループのメンバーが病原体に曝露された後にグルーミングされることによる抑制効果に対する反応性が低かった。 処理されたすべてのアリについて、抑制の強さは、病原体への曝露が高かろうが低かろうが、対照処理であっても、どの処理後でも同様に高かった（補足図10）。 したがって、アリが経験するあらゆる形態の妨害は、アリが他人の毛づくろいをすること自体をより消極的にするだけでなく（ρ）、他人から受け取る社会的フィードバックに対してより敏感になります（R）。

集団衛生管理の規制において私たちが特定した社会的フィードバックにより、アリは自身の病原体負荷、ひいてはアリがコロニーにもたらす感染リスクを継続的に評価できるようになる可能性があります。 このメカニズムが機能するために必要な条件は、より負荷の高い個体を優先的にグルーミングするアリの能力です。この能力がなければ（たとえば、均一なランダム選択ルールを使用する;図3d）、そのような社会的シグナルは有用な情報をまったく持たず、明確な適応値はありません。 したがって、感染力の高い個人の優先的なグルーミングと社会的フィードバックは、相乗的に組み合わされた 2 つの行動の説得力のある例を提供します。 魅力的な仮説は、社会的フィードバックは、特に継続的な毛づくろいや複数のアリが同じ個体を同時に毛づくろいすることによって強化された場合、個体自身の病原体量の直接的な自己評価よりも正確である可能性があるというものである。 これは、アリが自身の感染力に合わせて衛生管理を調整するための信頼できるメカニズムを構成し、それによって病原体を広める疫学的リスクを軽減する可能性があります 33。

私たちは、グルーミングの決定がグループの胞子除去効率にどのような影響を与えるかを定量化した。つまり、処理されたアリの巣仲間の頬下ポケットに集めてペレットとして不活化することによって、曝露後90分間にアリが胞子を除去した割合を定量化した。 高負荷のアリをより頻繁に標的にすることに成功したグループ（より良い選択者）は、より頻繁に高負荷のアリを選択したグループ（より悪い選択者;図7a、補足図11）よりも多くの胞子を除去したことがわかりました。 次に、別の機能的ノックアウト実験を実行することにより、選択した完全な予防が胞子除去効率にどのような影響を与えるかを評価しました。 自由選択のあるグループ（初期設定と同様、2 匹の治療を受けた 4 匹の巣仲間のグループ）での胞子除去と、自由選択のない他のグループ（最初のグループを 2 つの半分に分け、それぞれ 2 匹の治療を受けたグループ）での胞子除去を比較しました。巣の仲間と処理された 1 個体のみ; 合計 462 匹のアリからなる n = 98 グループ、4 つの選択状況と 3 つの非選択状況をそれぞれ 14 回反復、方法を参照)。 我々は、選択なしのシナリオにおける総胞子除去量、つまり 2 つの分割された半グループの胞子除去量の合計は、最初の胞子負荷量の差とは無関係に、対応する分割されていない自由選択グループの胞子除去レベルに決して達しないことを発見しました。処理された 2 匹のアリ (図 7b)。

a 巣の仲間が負荷の高い個体をより多く毛づくろいした主実験のグループ（モデルが予測する毛づくろいの好みが高く、反復ごとに 5 回のシミュレーションにわたる平均 ± 標準偏差）は、巣仲間の同種グルーミングとペレット形成によってより多くの胞子を除去します（推定検出を使用した測定平均 ± 標準偏差）。エラー; n = 82 反復; 与えられた線形関数モデルの r2; 補足図 11 も参照)。 b 選択状況（つまり、巣の仲間が2匹の処理されたアリから選択できる）と比較して、アリが選択できないようにした（つまり、巣の仲間が処理された1匹のアリのみに直面した）場合の機能的ノックアウト実験。 除去された胞子の総数（巣仲間の頭部で収集され、グループごとにペレットとして排出されたもの、n = 98 グループ、4 つの自由選択状況と 3 つの無選択状況のそれぞれ 14 つ）の比率。右側の緑の点は、異なる選択シナリオにわたる平均を示します。左）は、一致した選択なしの状況と比較して、自由選択の方が高いです（ブートストラップによって計算された、薄緑色のヌル分布との比較、n = 105、片側 p = 0.047。補足ノート 3 を参照）。 重要なのは、すべての選択状況 – 難しい (初期胞子量が高い胞子処理個体 2 匹、黒アリ 2 匹)、中程度 (初期胞子量が異なる胞子処理個体 2 匹、黒アリと灰色アリ)、または簡単な選択 (1 匹だけ)高負荷の胞子で処理した 2 匹の個体のうち、もう 1 匹はコントロールで処理した (黒アリと白アリ) – 選択をした場合と選択しなかった場合で同様の胞子除去率を示しました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

総合すると、より優れた選択者で観察されたより高い胞子の除去（図7a）、および観察された選択権のあるグループのより高い胞子除去（図7b）は、個々のアリの決定における多くの小さなグルーミングバイアスが蓄積されて機能的利益につながっていることを示しています集団レベルで。 個々のアリが、より高い負荷の個体を優先的にターゲットにする能力（均一にランダムに選択するのではなく、図3d、補足注1）と、より高い胞子負荷でのより高いグルーミング効率（タイプIIの機能応答モデル、上記を参照）と組み合わせて、グループレベルで高効率の病原体除去を実現します。 この効果は、わずか 6 匹のアリの実験グループですでに検出可能であり、これらの非常に小さなグループ サイズで集団的な利益がすでに現れている可能性があるという以前の報告と一致しています。

この研究では、アリの集団衛生の基礎となる個々の意思決定ルールを抽出しました。 これらのルールは、短期記憶、接触ベースの社会的フィードバック、およびローカルでアクセス可能な病原体の脅威情報のみを必要とするため、認知的に単純で、拡張性があり、もっともらしいものです。 個々のアリのレベルで影響を与えるこれらの制限にもかかわらず、特定されたルールは相乗的に相互作用し、コロニーレベルで予想される疫学的利点を伴う効率的な病原体の除去に増幅されます。 以下では、この相乗効果がどのようにして生じるかを合理的に説明します。

最初の重要な要素は、現在の病原体負荷を動的かつ継続的に再評価することです。 たとえ個人の認知能力が限られているとしても、この動的な更新はアリが迅速かつ適切に反応するための鍵となります。病原体の負荷、したがって伝播リスクは固定されておらず、アリの衛生行動自体の結果として継続的に変化するため、継続的な更新が必要です。情報更新中。 第二に、アリは現在の病原体負荷が高い個体を毛づくろいの対象として高い確率で狙うという事実と、病原体負荷が高い場合に高い胞子除去率を可能にする毛づくろいの機構的側面が組み合わさって、コロニー全体の非常に効率的な病原体除去を実現します。 第三に、他人に知覚される病原体負荷は毛づくろいを促進する興奮因子である一方、自分自身の病原体負荷は毛づくろいのパフォーマンスを阻害し、それによって感染の拡大を制限します33。 自分自身の病原体負荷はアリによって間接的に評価されているようで、グルーミングを受けるという形で他人からの社会的フィードバックが必要となる。このメカニズムが機能するには、グルーミングは感染性アリに優先的に向けられる必要がある。 最後に、アリが自分自身の撹乱に関する情報を個別に取得する場合、社会的に取得した情報に対してより反応的になることがわかり、社会性昆虫における内部情報と外部情報の統合の関連性が繰り返し示されました 55,56。

まとめると、コロニー内の効率的な集団衛生は、行動選択の機械的な増幅、フィードバックを通じた興奮性因子と抑制性因子の相互作用、および個人および社会的な情報処理から生まれます。 特定されたルールは、自身の感染力が最も低い個体による、最も感染力の高いコロニーメンバーの優先的なグルーミングに貢献しており、コロニーの病気のリスクを軽減するために重要であることが疫学モデリングによって特定されています33。 最近の技術進歩により、社会科学、物理科学、生命科学にわたる集団行動に関する多くの研究が促進されたにもかかわらず、創発的行動のそのような直接的な機能的利点、つまり進化的関連性を正確に特定することはほとんどできません58、59。 私たちの結果は、社会性昆虫の進化における集団行動の重要性を示しています。昆虫の適応度は、体内の細胞などの他の協力的な存在と同様に、本質的にグループレベルのパフォーマンスに依存します60、61、62。

宿主種として、外来種の庭アリ、Lasiusgnoregus を研究しました。 私たちは、2015 年 6 月と 2022 年 9 月に、ドイツのイエナ (北緯 50° 55.910 東経 11°35.140)63 にある植物園に導入されたスーパーコロニアル個体群から、この種の数百羽の働きアリ、複数の女王バチ、ひなを収集し、実験室で飼育しました。砂糖水と刻んだゴキブリ。 実験は、相対湿度65%、摂氏23度に湿度と温度が管理された部屋で、古い採餌者と羽化したばかりのキャロウの両方を避けるために、巣内の働きアリの部屋からサンプリングされた働きアリを用いて行われた。 この保護されていない種の収集とすべての実験作業は、ヨーロッパとオーストリアの法律と組織の倫理ガイドラインに従って行われました。

病原体として、我々は、Lasius65を含むアリ64の一般的な自然病原体である偏性致死性昆虫病原性真菌Metarhizium、特に統合グリーン（eGFP）を有するMetarhizium robertsii株ARSEF 257566の感染性分生子（ここでは胞子とも略記する）を使用した。または赤色（mRFP1）蛍光標識（ブロック大学の M. Bidochka から入手。標識は GFP および RFP と略記されます）。 GFP 標識と RFP 標識した胞子は、アリに対する毒性に違いはありませんでした。

私たちは、漆喰のペトリ皿（Ø 35 mm、SPL Life Sciences）、ガラスカバー付き（Ø 51.5 mm、Edmund Optics）。 4 人の働きアリは治療を受けずに残り、巣の仲間 (N) と呼ばれます。 残りの 2 人は、最初の 30 分間の撮影期間 (前治療期間) の後にランダムに選ばれ、3 つの治療のうちの 1 つで治療されました。高用量の真菌病原体の F 治療、低用量の真菌病原体の F 治療、すなわち、高用量の真菌用量の半分、または病原体を含まない対照処理からなるC処理。 これら 3 つの個別のアリ処理をすべてペアごとに組み合わせた結果、6 つの異なるグループ処理 (FF、Ff、ff、FC、fC、CC、図 1a) が得られました。 病原体にさらされた2匹のアリ（FF、Ff、ff）がいるグループで胞子の起源を区別できるようにするために、1人の働きアリにはGFP標識された胞子が与えられ、もう1人の働きアリにはRFP標識された胞子がランダム化された方法で与えられました（補足表1）。 。 処理されたアリは処理後すぐにグループに戻され、すべてのアリの行動がさらに 90 分間 (処理後期間) 撮影され、合計 2 時間の撮影が行われました。 撮影は 4 台のカメラの並列セットアップで実行され、一度に撮影される 4 つの複製の治療グループがランダムに割り当てられ、合計 6 日間の記録にわたって 1 日を通して治療グループが分散されるバランスの取れたデザインが実現しました。 (IDS UI-1640LE USB 2.0 CMOS、15 fps、1024 × 1024、1.3MPixel、1.3 インチ Aptina センサー、ローリング シャッター カメラ、固定焦点距離レンズ 6MM 1/1.8 インチ f 1.4-f/16 C-マウント、Edmund Optics; Streampix 5 デジタルビデオ録画ソフトウェア [NorPix, Inc.] を使用して取得)。 撮影後、すべてのアリとアリが吐き出した胞子ペレットは、後の病原体負荷の定量化のために -80 °C で凍結されました。 元の 108 の反復 (処理グループごとに 18) から、実験実行中に発生した技術的エラーのために 9 を除外する必要があったため、6 つの処理グループごとに 16 ～ 17 の反復が得られました (6 匹のアリからなる n = 99 の反復グループ、合計 594 匹のアリ、そのうち 66F、65f、67C、および 396N;補足表 1)。

M. robertsii の感染性分生子は、実験前に新鮮な 6.5% サブロー デキストロース寒天プレートから滅菌 Triton X-100 (Sigma; 0.05%、milliQ 水で希釈) に採取され、発芽は >95% であることが確認されました。 病原体で処理された作業員は、F 作業員の場合は 1 mL あたり 1 × 109 個の胞子の濃度で、F 作業員についてはこの濃度の半分である 5 × 108 個の胞子/mL の濃度の真菌胞子懸濁液の 0.3 μl 液滴に個別に曝露されました。 。 C 労働者には、同量の滅菌 Triton X-100 のみの対照治療を受けさせました。 この目的のために、各アリを鉗子で保持し、その腹部を、液滴が完全に取り込まれるまで、清潔なスライドガラス上に置かれたそれぞれの治療懸濁液の液滴を通して静かに引き抜いた。 曝露直後の胞子の定量化（以下に詳述）により、この処理により F ワーカーには 2.00 × 105 個の胞子（中央値、四分位範囲 IR 1.36〜2.55 × 105、n = 30）と 1.04 × 105 個の胞子が効果的に適用されたことが明らかになりました。 f-ワーカーの胞子 (IR 0.88−1.31 × 105; n = 30)。

私たちは、行動ロギング ソフトウェア (Solomon Coder v. 17.067) を使用して、合計 2 時間の実験期間中、594 匹のアリそれぞれの個人的行動と社会的行動を分析しました。各イベントの終了フレーム。 アリの治療は、色に関係なくランダムに選ばれた2匹の個体に適用されたため、観察者はアリの色と治療の間、複製および治療グループ内でも、グループ間でも、関連付けを行うことはできませんでした。 アリの色と処理の割り当てもビデオでは明らかにされていないため、バイアスのない行動スコアリングが保証されます。 我々は、(i) アリ自身の頭または体の自己グルーミング行動、(ii) グループのメンバーに対して実行される同種グルーミング、(iii) グループのメンバーが受ける同種グルーミング、(iv) アシドポアからアリへの毒の取り込み行動のイベントの数と期間を決定しました。アリによる抗菌処理に使用されるアリの口 37、および (v) 胞子ペレットのペレットのデゴルジメント。 これらには、グルーミング中に頬下ポケットに収集され、圧縮されてペレットとして排出される胞子が含まれています。 また、他の行動もスコア化しましたが、これらは持続時間が短いため（1 フレーム、触角ストロークの 1/15 秒に相当）、まれに発生するため（食物交換行動、栄養性指向性）、分析には含めませんでした。 アリが攻撃的な行動をとる様子は観察されませんでした。 さらに、これらのグルーミング以外の遭遇をグルーミングとの関連で設定するために、2つのアリのグループ（1つのFfと1つのFCの例）の処理後の最初の30分間の触角行動（持続時間が短いためイベントとして記録）を詳細に観察しました。出会い。

実験終了後、つまり治療個体の治療から90分後、我々は594匹のアリそれぞれの胞子数と、アリが産生したペレットに詰まった胞子の数を定量した。 アリの各グループによって生成されたペレットは胞子の定量化のためにプールされ、n = 77 のペレット プールが得られました（17 の CC 複製、3 つの fC 複製、および 1 つの FC 複製のいずれでもペレットは生成されず、1 つのサンプルは定量化前に失われました） ）。 さらに、実験には使用されませんでしたが、F または F 用量の適用直後に凍結された追加の 75 匹のアリの胞子数を定量しました（各 n = 30、そのうち 15 匹は GFP- を使用し、15 匹は RFP- を使用しました）。実験の開始時に処理されたアリの最初に適用された胞子量を決定するために、Triton X-100 による対照処理 (C; n = 15) を行いました。 GFP および RFP の使用量はアリの処理、色、反復ごとにランダム化されており、サンプルのラベルには処理情報が含まれていませんでした。

凍結後、きれいなメスで各アリの頭を取り除き、その頭と体を別々に処理して、明確な推定値を取得しました。(i) 毛づくろい中に各アリの頭の内側の頬下ポケットに収集された胞子。そこでは、次の方法で化学的に消毒されます。ペレットとして排出される前にアリが取り込んだ毒37、および (ii) アリの体表に残っている胞子。これは、胞子処理されたアリの体から除去されなかった胞子と、相互汚染による巣仲間の体の汚染を表します。補足図 1;以下も参照)。 1415 個のサンプル (アリの解剖サンプル 1338 個とペレット プール 77 個) のそれぞれについて、マルチプレックス液滴デジタル PCR (ddPCR) アッセイによって、GFP および RFP 標識された胞子の絶対数を同時に取得しました。

この目的を達成するために、すべてのサンプルを、1 個の 2.8 mm セラミック (VWR)、5 個の 1 mm ジルコニア (BioSpec Products)、および約 5 個の 1 mm ジルコニア (BioSpec Products) の混合物を使用して、TissueLyser II (Qiagen) で均質化しました。 参考文献のように、100 mg のガラスビーズ (425 ～ 600 μm; Sigma) を 2 つのステップ (30 Hz で 2 × 2 分) で行います。 21. Qiagen DNeasy96 Blood and Tissue Kit を製造元の指示に従って使用し、最終溶出量 50 μl Buffer AE で全 DNA を抽出しました。 2 つの標識された胞子バリアントの絶対定量を同時に実行するために、シングル コピー mRFP1 (KX176868.1) およびシングル コピー eGFP 遺伝子配列 (NC 025025.1) をターゲットとするマルチプレックス ddPCR プローブ アッセイを設計しました。 プライマーとプローブは Primer3Plus68 を使用して設計されており、目的のそれぞれの遺伝子を独占的に増幅することが示されています。 ゲノム DNA を、EcoRI-HF および HindIII-HF 酵素 (両方とも New England Biolabs) を使用して、プローブ用 2x ddPCR Supermix (Bio-Rad) 10 μl、両方の eGFP プライマー (14 pmol) を含む 20 μl ddPCR 反応液内で消化しました。順方向: 5'-AAGAACGGCATCAAGGTGAA-3'、逆方向: 5'-GTGCTCAGGTAGTGGTTGTC-3'; Sigma)、18 pmol の両方の mRFP1 プライマー 69 (順方向: 5'-CTGTCCCCTCAGTTCCAGTA-3'、逆方向: 5'-CCGTCCTCGAAGTTCATCAC-3'; Sigma)、5 pmol の eGFP プローブ (5'-[HEX]CAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAAC-3' [BHQ1]、Sigma)、5 pmol の mRFP1 プローブ (5'-[6FAM]AGCACCCCGCCGACATCCCCG-3' [BHQ1]、Sigma)、10 EcoRI-HF および HindIII-HF (両方とも New England Biolabs)、2.8 μl ヌクレアーゼフリー水 (Sigma)、および 2 μl DNA テンプレート。 液滴の生成は、メーカーの推奨に従って QX200 液滴生成器 (Bio-Rad) を使用して行われました。

液滴を96ウェルプレート(Eppendorf)に移し、T100サーマルサイクラー(Bio-Rad)でPCR増幅を行った。 サイクル条件は次のとおりです: 95 °C で 10 分間の酵素活性化、その後 94 °C で 30 秒および 56 °C で 1 分間のサイクルを 40 サイクル、その後 98 °C で 10 分間の酵素失活。 プロトコル全体で、昇温速度は 2 °C/秒に設定されました。 PCR増幅後、陽性および陰性の液滴を読み取るために、PCRプレートをQX200液滴リーダー(Bio-Rad)に入れました。 データ分析は、QuantaSoft™ Analysis Pro ソフトウェア (Bio-Rad、バージョン 1.0) を使用して行われました。 しきい値は、FAM (mRFP1 のレポーター) の場合は 3000、HEX (eGFP のレポーター) の場合は 2000 に手動で設定されました。 総液滴数が 10,000 未満のサンプルを繰り返しました。 胞子の定量化におけるバックグラウンドノイズは、非標的チャネルで読み取られたコピーの最大数として定義されました（つまり、eGFP 曝露の場合は FAM チャネルの読み取り、mRFP1 曝露の場合は HEX チャネルでの読み取り）。 バックグラウンドノイズレベル（mRFP1の場合は8コピー、eGFPの場合は12コピー）を下回る値は考慮されませんでした。 結果はソフトウェアによってコピー数/20 μl ウェルとして表示され、そこからサンプル (アリの頭、体、またはペレットなど) あたりの胞子の絶対数を計算しました。

90分間の社会的相互作用の後、最初に適用された胞子のわずか20％未満が胞子処理個体の体に残っていることがわかりました（F：胞子数中央値27497、CI 24254 – 32421、n = 66、f：中央値） 13710 胞子、CI 9141–17120、n = 65)。 さらに、約。 胞子で処理されたアリは、2 回おきに、他の処理個体からの低い胞子数にも感染しました (伝染が発生した場合の胞子数; F: 胞子中央値 84、CI 47 ～ 119、n = 41; f: 胞子 71.5、CI 11.5 ～ 98、 n = 28)、これは、自身の曝露によりまだ残っている胞子の最終負荷の 0.3% (F) ～ 0.5% (f) の一部に相当します。 巣の仲間はより高い割合で病原体に感染した。 胞子処理アリとの90分間の相互作用後、巣仲間の84％（少なくとも1匹の病原体処理アリがいる82群の未処理巣仲間328匹のうち275匹）の体から胞子が検出された。 ここでも、伝染する胞子の数は非常に少なく、胞子に感染した巣の仲間 1 匹あたりの胞子数の中央値は 96 個 (CI 83 ～ 102、n = 275) でした。 ほぼすべての巣の仲間（311/328、95％）が頭部に胞子を集めており、中央値は1453個の胞子（CI 942-1836）であり、最近のグルーミング活動を反映していました（補足図4）。

我々は、巣仲間の頭部サンプルからddPCRによって定量化されたすべての胞子を頬下ポケットに収集された胞子として考慮することによって導入される誤差を評価する保守的なアプローチを使用しましたが、一部は頭部嚢の外側に付着している可能性があります。 この目的を達成するために、我々は、最高の総胞子負荷（FF）を有する処理グループのさらに 2 つの複製を設定し、2 つの F との 90 分間の相互作用後に 4 匹の巣仲間の頭部嚢の外側で検出可能な胞子の数を分析しました。 -蛍光実体顕微鏡法による個体（フィルターキューブを備えたライカ MZ16 FA: ET DsRed; ソフトウェア: Leica Application Suite Advanced Fluorescent 2.3.0; as in41）。 主な実験とは対照的に、ここでは両方の F 個体を RFP 標識胞子で処理しました。これは、(i) この標識はアリの表皮の自己蛍光と明らかに対照的であり、(ii) 胞子の総数のみに興味があるためです。それは巣の仲間の頭のカプセルに付着します。 私たちは、すべての巣仲間の頭部を 30 分間スクリーニングすることにより、8 羽の巣仲間の頭部のカプセルに蛍光胞子の存在があるかどうかを注意深く検査しました。 一部の胞子が見落とされた可能性を排除することはできませんが、巣の仲間の頭部のカプセルの汚染が、たとえば目の周りや触角上に見られる非常に少数の胞子に限定されていたことが明らかになりました。 8 匹の巣仲間のうち 3 匹では胞子が検出されず、胞子を持った巣仲間の胞子数は中央値 3、最大 4 でした。 したがって、ddPCR 法を使用した実験で巣の仲間の頭部サンプル中の 4 つを超える胞子を定量した場合は常に、胞子が頬下ポケット内にあると確信できます。 処理グループ全体の巣の仲間の頭部サンプル中に中央値約 1500 個の胞子があったことを考えると、私たちの方法によって導入されたノイズは非常に小さいと考えられます。

胞子処理されたアリ (F、f) のそれぞれについて、処理後 90 分間の時間枠 30 秒の分解能 (合計 180 時間窓) で、その体上の現在の胞子負荷汚染を以下から推定しました。 (i) 実験終了時に体に残っていた GFP 胞子数と RFP 胞子数の合計、(ii) 体を自分でグルーミングした時間、および他の人によってグルーミングされた時間、および (iii) 胞子量の初期分布F および F 処理後、曝露直後に凍結した 30 名の F および F 作業員について定量化。 アリの胞子数がグルーミングによってどのように減少するかについての数学的モデル (胞子減衰モデル) が与えられると、残りの測定された胞子数 (i) とグルーミング イベントのシーケンスから各アリの胞子負荷を逆計算できます。 (ii) 実験中の任意の時刻 t まで。 すべての F アリおよびすべての f アリの胞子負荷が実験の開始時に逆計算される場合、それらは実験的に測定された分布を回復するはずです (iii)。 最後の事実により、最適な胞子減衰モデルを選択し、そのパラメーターを適合させることができ、その後、実験中いつでも胞子負荷を代入できるようになりました。

最良のモデルを見つけるために、まず胞子減衰の単純なモデルを検討しました。このモデルでは、毛づくろいの際に胞子は 0 次 (一定速度) または 1 次 (指数関数的) 速度論で減少します。 これら 2 つの単純なモデルには、制限動作に問題があるか、測定された初期胞子分布を再現できませんでした。 これらの欠損は、h = 1 ヒル関数またはミカエリス メンテン反応速度論としても知られる、タイプ IIFRM に触発された胞子崩壊モデルによって自然に処理されます。 ここで、アリは時間の経過とともに胞子 (S) を除去します。 dS/dt = −vS/(S + K) として、定数 v と K を当てはめます。t はアリが毛づくろいされている時間であり、毛づくろいには次のものが含まれます。アロググルーミング（複数のアリが単一の標的アリを同時に毛づくろいするイベントを適切に考慮する）と体の自己グルーミングの両方。 汚染された個体の体に高い胞子負荷（S >> K）がかかると、アリによるグルーミングによる除去は最大速度 v で発生します（おそらく、アリが胞子を除去できる速さの物理的限界によって与えられると考えられます）。 この体制では、汚染されたアリの胞子の数は、毛づくろいの時間とともに直線的に減少します。 胞子数がさらに減少すると（S << K）、単位時間当たりに捕捉できる胞子は少なくなり、胞子の除去速度は（制限された）現在の負荷 S に比例するようになり、したがって胞子数は手入れの時間とともに指数関数的に減少します。 ミカエリス・メンテン反応速度論における解離定数として知られる K は、指数関数的領域と線形領域の間の遷移を与えます。 実験データからパラメーター v と K を適合させたので、モデルによって予測された逆計算された胞子負荷の初期分布が、F- および f- の胞子の定量化から決定された初期胞子負荷分布に最もよく適合することがわかりました。曝露直後のアリ（詳細については補足表 3 を参照）。 2 つのパラメータは、2 つの分布 (F および f ant の初期荷重分布) のそれぞれの 2 つのモーメント (中央値と SD) に最もよく適合するように選択されます。つまり、2 つのパラメータは 4 つの制約を最もよく満たすように選択されます。 パラメータ空間内の 2D グリッド全体をスキャンし、フィッティング損失関数の単一の明確な最適値を観察することにより、フィッティング値が一意に制約されていることを確認しました。 最適化基準の選択 (ここでは、分布の中央値と標準偏差の一致) に関する v、K パラメーター推定値の堅牢性は、分布間の土工機の距離を最小限に抑えることで同様の値を回復することによってさらに裏付けられました。

追跡実験では、アリが処理されたアリのどちらかを選択できないようにすると、胞子の除去効率が低下するかどうかをテストしました。これは、主な実験でより適切に選択したアリのグループと比較して、より悪い選択をしたグループでは胞子除去率が低いことが示唆されています(図7a)。 この機能的ノックアウト実験では、上記のように巣の仲間 4 匹と処理された個体 2 匹を含むアリのグループを設定するか (自由選択の状況)、または巣の仲間 2 匹と処理された個体 1 匹だけからなるように設定を半分に分割します (なし)。 -選択状況)。 選択状況では、アリの 1 匹は常に高用量 (F; 1 × 109 胞子/mL) で処理され、2 番目のアリは (i) 対照懸濁液 C (簡単に選択)、(ii) より低い用量のいずれかで処理されました。胞子線量（1/4 F または 1/2 F、つまり 2.5 × 108 個、1 mL あたり 5 × 108 個の胞子、中程度の選択の難しさを表す）、または (iii) 同じ F 線量 (選択が難しい)。 選択のない状況には、3 つの胞子投与量 (F、1/2 F、1/4 F) のいずれかで処理された 1 匹のアリが含まれていました。 合計 98 個のアリのグループを分析しました (7 つの状況をそれぞれ 14 回繰り返し、合計 n = 462 匹のアリ、そのうち 308N 匹)。 実験の 16 ～ 24 時間前に、アリは上記のように色分けされましたが、すべての N が同じ色を受けました。 ピークのグルーミング活動（図4a）をカバーするために、曝露後20分で皿を凍結し、グループによって除去されたすべての胞子を定量するための病原体負荷定量化に続くために、皿ごとにすべての巣仲間の頭とペレットをプールしました。 この目的を達成するために、アニーリング温度を 60 °C に設定し、閾値を FAM で 2200、HEX で 1800 に設定し、ノイズ レベルを mRFP1 と mRFP1 の両方で 3 コピーとしたことを除いて、上記のように 98 サンプルの DNA を抽出しました。 eGFP。 DNA抽出では、ストックコロニーからの2頭の働きバチの頭を、42の無選択グループの2頭だけの巣仲間の頭に追加して、4匹の巣仲間と同量の宿主組織を含むようにすることで、選択状況と選択なしの状況の間で同等の条件を確保しました。選択状況で表に立つ (n = 56)。

統計データ分析は、R v.3.6.3 および Matlab v.2016b で実行されました。 すべてのモデルについて、モデルの仮定 (つまり、残差正規性と異質性、多重共線性なし、過分散なし) と影響力のあるケースをチェックしました。 glmmTMB70 と lme471、および診断ツールとして DHARMa72 を使用して、一般化線形混合モデルを構築しました。 さらに、データの書式設定には Tidyverse73、forcats74、data.table75、stringr76 を使用し、統計の要約と推論には stats77 と multcomp78 を使用しました。 効果サイズ79は、Rパッケージeffectsize80、rcompanion81、およびrstatix82を使用して計算されました。 複数の推論が行われた場合、5% の誤検出率から保護するために、Benjamini-Hochberg 手順を使用してすべての有意値が修正されました83。 調整された p 値が報告され、主実験から得られたアプリオリな仮説に基づいて構築された選択防止実験 (図 7b) を除いて、すべて両側性です。 1e−11 より大きい場合、正確な p 値が得られます。 グラフは、R パッケージ ggplot284、cowplot85、ggpubr86、scales87、および Matlab v.2016b (Math-Works) を使用して作成されました。

99の複製（補足表1）の594匹のアリのそれぞれについて、体と頭の自己グルーミング、毒の摂取、同種グルーミングの効果的な時間、および同種グルーミングを受けたかどうかをテストしました（図1b〜d、補足図2、および補足表 2)、個々の治療、つまり高負荷 (F)、低負荷 (f)、対照治療 (C) の個体、および未治療の巣の仲間に応じて、一対のウィルコクソン検定によって治療前と治療後の期間が異なります。 (N)。 巣の仲間については、グルーミングに費やした時間が、自分がグルーミングしたアリの扱いに依存するのか、それとも最後にグルーミングされたアリが誰によって依存するのか（セルフグルーミング前の最大時間枠は 3 分）をさらに分析しました。クラスカル・ウォリス検定とそれに続く事後比較の結果（補足図3）。

未処理の巣の仲間が胞子処理した 2 匹のアリのうちの 1 匹を毛づくろいすることを選択したすべての毛づくろいイベント (胞子処理した 2 匹のアリの 49 回の反復から 196N によって実行された n = 5001 個の個々の毛づくろいの選択) について、現在の胞子負荷を計算しました。どちらのアリも、上で詳述したタイプ II 機能応答モデルを使用して処理されました。 グルーミングの選択ごとに、グルーミングされたアリの現在の胞子の割合を、処理された両方のアリの現在の胞子量合計に対するターゲットアリの現在の胞子量として導出し、観察された分布を均一なランダム選択のヌル期待と比較しました（図2c） ）コルモゴロフ・スミルノフ検定による。 さらに、すべてのグルーミング イベントをグルーミングされた個体の現在の胞子比率の 10 のカテゴリに分け、特定の期間のイベントがそれぞれに該当する数をカウントすることにより、グルーミング イベントの期間とグルーミングされた個体の胞子負荷比率の考えられる関係についてテストしました。カテゴリ、続いてコルモゴロフ – スミルノフ検定 (図 2d)。

我々は、それぞれ標識された胞子でアリに対して行われたグルーミングの継続時間（GFP対RFP）が、少なくとも1匹の胞子処理個体（FF）を含む82グループの巣仲間の頭部におけるこれらの胞子の存在を予測するかどうかをロジスティック回帰によってテストした。 、Ff、ff、FC、fC; n = 328N、そのうち196は胞子処理された2人の個人と接触し、合計n = 524のデータポイントにつながりました（補足図4a）。巣の仲間の頭で検出された胞子の数と、実験終了前のさまざまな間隔で毛づくろいをした時間（補足図4b）。

グループごとに生成されたペレットの数（病原体に曝露された個体 FF、Ff、ff、FC、ff を少なくとも 1 つ含むグループのみを含む; CC グループはペレットを生成しなかったため、n = 82 反復）が、クラスカル・ウォリス検定を使用して、グループ治療に依存し、ペレットあたりの胞子の数が治療グループ間で異なるかどうかを調べました（補足図5a）。 同じ個体の 2 回目から 4 回目の排出ペレットに相当する、巣の仲間による観察された 45 個のペレット排出すべてについて、観察された連続したペレット生成の間にアリが同種グルーミングに費やした時間が実験の段階に依存するかどうかを、クラスカル・ワリス検定を使用してテストしました。 (補足図5b)。

処理された 2 匹のアリが異なる初期胞子量を受けたグループ (Ff、FC、fC; 49 回の反復から 196N による n = 4915 のグルーミング イベント) について、より負荷の高い個体をグルーミングする巣メイトの好みが次の条件によって予測できるかどうかをテストしました。胞子処理された2個体の初期胞子量の差（補足図7）、巣の仲間がより高い初期適用胞子量（F in Ff、F in FC、f in fC）で個体をグルーミングする対数オッズ比を計算することにより、 ）。 さらに、処理された 2 匹のアリに対して巣の仲間が行ったすべてのグルーミングの選択を計算しました (合計 8​​,129 回のグルーミング決定 (328 N まで)、そのうち 5,001 回のグルーミング イベントは、2 つの胞子を用いた 49 回の反復で、現在負荷の高い個体に対する 196 N まででした)処理個体 FF,Ff, ff; および 1 つの胞子処理 FC と 1 つの対照処理 FC,fC による 33 回の反復における 132N による胞子を積んだ個体に対する 3128 回のグルーミング イベント、現在の個体をグルーミングする対数オッズ比胞子の負荷が高くなります。 スピアマン順位相関を計算して、現在の高負荷個体をグルーミングするための対数オッズ比が、すべての治療グループ（図6a）および1つまたは2つだけを含むグループについて個別に、2人の治療個体間の胞子負荷の差にどのように依存するかを決定しました。胞子処理された個体（補足図9）。 さらに、アリが最近他人から受けたグルーミングと、最後に他人からグルーミングを受けてからの時間の関数として同種グルーミング自体を実行する対数オッズ比を計算することにより、次に他人をグルーミングする自身の傾向との関係を明らかにしました（図6b）。および補足図10）。 グルーミングの好みのタイムラグへの依存性は、スピアマン順位相関によって評価されました。

巣仲間の毛づくろいの好みと胞子除去効率、つまり巣仲間の頭から回収された胞子の合計（n = 328N 頭サンプル）とグループごとに生産されたペレット（n = 77 ペレットプール）の総胞子に対する割合との関係を決定しました。複製内のすべてのアリとペレットから定量化されます。 少なくとも1人の胞子処理個体を含むすべてのグループの線形関数モデルをフィッティングすることにより、胞子の除去がグループ内の現在より負荷の高い個体に対するグルーミングの好みの程度と相関するかどうかをテストしました（図7a; n = 82反復）。 、または胞子処理個体2名（FF、Ff、ff; n = 49複製）と、胞子処理個体1名と偽処理個体1名（FC、fC; n = 33複製）のグループに分けて。 11)。 この分析では、負荷の高い個体（より良い選択者）に対するグルーミングの優先度が高いグループの方が胞子除去効率が高いことが示されたため、機能的ノックアウト実験で、自由選択のあるグループがより多くの胞子を除去できるだろうというアプリオリ仮説を検証しました。選択の有無にかかわらず、一致したセットアップで除去された胞子の比率を計算することによって、選択が妨げられたグループよりも胞子が減少しました。 自由選択と無選択の反復ラベルをランダムにシャッフルすることによって検定統計量が計算される、ヌル分布に対するブートストラップ 検定を使用して、この比率 (検定統計量) の有意性を評価しました。

補足情報には、補足注 3 にすべての統計テストの詳細な説明が含まれており、補足表 4 にすべての注文の詳細が含まれています。分析のソース データはソース データ ファイルとして提供され、コードは GitHub https:/ で入手できます。 /zenodo.org/badge/latestdoi/609868953。コードの入力生データ ファイルは https://research-explorer.ista.ac.at/record/12945 からアクセスできます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この調査で生成されたデータは、このペーパーにソース データ ファイルとして提供されます。 さらに、コードの生の入力データ ファイルは、オーストリア科学技術研究所の Research Explorer データベース (https://research-explorer.ista.ac.at/record/12945) に保管されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

GitHub では、(i) 実験データの統計分析、(ii) 研究で研究されたアリのグループの胞子除去行動のモデルの推論、および確率的シミュレーションのための完全なコードを提供しています。これらのモデルの。 1 つ目は、行動アノテーション ソフトウェアおよび胞子測定の出力ファイルからデータ テーブルを生成し、統計分析を生成し、実験データ分析用のプロットを生成するために使用できます。 後者は 3 つのタスクを実行します。(1) 実験入力ファイルを読み取って統計的に分析し、分析の結果を十分な統計の形式で保存します。 (2) 統計分析の出力を使用して、特定のタイプのモデルを推測します。 (3) 前のステップで推定されたレートと実験データの初期セグメントを使用して、推定されたモデルの確率的シミュレーションを初期化して実行します。 コードは https://zenodo.org/badge/latestdoi/609868953 で入手できます。

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真菌株については Mike Bidochka、アリの収集については ISTA Social Immunity Team、実験および分子サポートについては Hanna Leitner、顕微鏡検査については Jennifer Robb と Lukas Lindorfer、一般的な実験室サポートについては ISTA の LabSupport Facility に感謝します。 さらに、全体を通じて継続的なフィードバックを提供してくれた Victor Mireles、Iain Cousin、Fabian Theis、および社会免疫チームに感謝します。また、原稿に関するコメントを提供してくれた Michael Sixt、Yuko Ulrich、Koos Boomsma、Erika Dawson、Megan Kutzer、および Hinrich Schulenburg に感謝します。 このプロジェクトは、欧州連合の Horizo​​n 2020 研究革新プログラム (助成金番号 771402; EPIDEMICSonCHIP) に基づく欧州研究評議会 (ERC) から、スロバキア共和国科学助成庁 (助成金番号 1/0521) から SC への資金提供を受けています。 /20) を KB に、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム (助成番号 RGP0065/2012) を GT に譲渡しました。

Barbara Casillas-Pérez、Katarína Boďová などの著者も同様に貢献しました。

ISTA (オーストリア科学技術研究所)、Am Campus 1、AT-3400、クロスターノイブルク、オーストリア

バルバラ・カシージャス＝ペレス、アンナ・V・グラース、ギャシュペル・トカチク、シルヴィア・クレメール

コメニウス大学、数学、物理学、情報学部、数学解析および数値学科、ムリンスカ ドリーナ、SK-84248、ブラチスラヴァ、スロバキア

カタリーナ・ボイオバ

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SC、BCP、KB、GT が研究を概念化しました。 実験データは BCP と AVG によって生成され、BCP によってキュレートされ、BCP、KB、GT によって分析されました。 モデリングは、GT の入力を使用して KB によって実行されました。 図は、BCP と KB によって作成されました。 原稿は、SC、GT、BCP、およびKB であり、すべての作成者によって承認されています。 資金はSC、KB、GTによって獲得されました

Gašper Tkačik または Sylvia Cremer への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Peter Biedermann 氏、Theodore Pavlic 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Casillas-Pérez, B.、Boďová, K.、Grasse, AV 他動的な病原体検出と社会的フィードバックがアリの集団衛生を形成します。 Nat Commun 14、3232 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38947-y

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受信日: 2022 年 9 月 23 日

受理日: 2023 年 5 月 23 日

公開日: 2023 年 6 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38947-y

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